Anaérobies strictes
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1. Qu'est ce que les anaérobies strictes
- Pourquoi l'Oxygène est-il toxique ?
En présence d'oxygène, il y a formation de molécules particulières,
les peroxydes.
Ces peroxydes sont entre autres :
l'ion superoxyde, le peroxyde d'hydrogène ou eau oxygénée ...
Une réaction est particulièrement importante pour la production d'H
2O
2
: c'est la réaction de l'oxygène avec les coenzymes flaviniques comme FADH
2 :
FADH2
+ O2
--> FAD + H2
O2
Il semble aussi que la dernière réaction de la respiration, la réduction de l'Oxygène,
donne dans un premier temps des ions superoxydes :
e- + O2
--> O2.-
2H+
+ 2 O
2.-
--> H2O
2 + O
2
Pourquoi les peroxydes sont-ils toxiques et comment les éliminer ?
Ces peroxydes sont des oxydants puissants qui détruisent les molécules organiques
(DNA, protéines) et qu'il faut éliminer par des enzymes comme :
- la superoxyde dismutase
- la catalase
- les peroxydases.
D'ailleurs ces peroxydes sont utilisés par le macrophage notamment pour tuer les cellules étrangères.
Les êtres vivants qui ne possèdent pas ces enzymes meurent en présence d'oxygène
et sont donc anaérobies strictes.
Ceux qui en possèdent peu ou seulement des peroxydases cultivent préférentiellement en anaérobiose
(Streptococcus, Lactobacillus).
Cette interprétation est une approche classique qui sera un jour éclairée par d'autres données :
il existe en effet des anaérobies strictes catalase positive !
Certaines bactéries sont mêmes EOS (Extremement Oxygen sensible) : elles ne peuvent survivre,
même brièvement, en présence d'une faible concentration de dioxygène.
Ces EOS sont très nombreuses dans la flore fécale
et appartiennent souvant aux Archaéobactéries.
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2. Méthodes d'étude des Bactéries anaérobies strictes
2.1 méthodes pour obtenir et conserver l'anaérobiose
Le but fondamental est d'éliminer l'oxygène.
Mais il faut de plus éviter qu'il ne revienne, le conditionnement est donc essentiel avec :
- des tubes à section étroite
- des milieux gélosés où l'oxygène diffuse mal
- des milieux sous paraffine ou vaseline
- des enceintes hermétiques ou jarres ou des hottes anaérobies.
régénération des milieux
C'est le procédé de dégazage le plus simple : l'ébullition assure par diminution de la solubilité
des gaz avec l'augmentation de la température,
le départ de l'oxygène (et des autres gaz de l'air).
réduction chimique de l'oxygène
- par molécules réductrices dans le milieu
Des molécules peuvent être ajoutées dans le milieu en assurant une certaine anaérobiose.
On les utilise donc en combinaison avec d'autres méthodes comme la régénération.
Ces molécules ne doivent pas être toxiques pour les micro-organismes.
On utilise la CYSTEINE ou des morceaux d'organes contenant de la CYSTEINE
(Cervelle, rein, foie ...).
En effet la cystéine est réductrice : deux molécules de cystéines s'unissent par un pont disulfure
en libérant deux électrons.
On utilise aussi le thioglycolate de sodium (retrouvé dans les milieux pour hémocultures)
appelé aussi acide mercaptoéthanoïque de formule HS-CH2-COOH.
par l'hydrogène en jarre
La génération de l'hydrogène est obtenue par réaction d'ions H + de l'eau sur
l'hydrure (sous forme de borohydrure) :
BH4
- -->
BH3 + H- (ion hydrure : un proton entouré de deux électrons donc chargé -) ou
H-
+ H+
--> H
2
L'hydrogène réagit avec l'oxygène en présence d'un catalyseur afin d'éviter l'explosion
pour donner de l'eau.
En règle générale, un dégagement de dioxyde de carbone est réalisé en même temps
car il favorise la culture de ces bactéries.
Les systèmes commercialisés comme GasPack®, sont formés d'un sachet contenant deux comprimés
contenant l'un le borohydrure de sodium et de l'acide citrique,
le deuxième de l'hydrogènocarbonate de sodium et de l'acide citrique
comme dans les comprimés effervescents.
L'addition d'eau permet la réaction et impose le placement rapide du sachet dans la jarre
et sa fermeture.
Il convient d'éviter une flamme proche à cause du dihydrogène.
Remarque : le système Generbag Mérieux permet probablement par le même mécanisme
l'obtention d'une atmosphère anaérobie en sachet.
par du fer pulvérisé (Merck)
Merck commercialise un système analogue à base de fer comme réducteur.
atmosphère gazeuse artificielle
L'air est éliminé par des gaz purs : azote par ex.
Des milieux sont conditionnés sous azote comme le milieu pour la galerie API20A.
Les enceintes anaérobies sont de même sous une atmosphère artificielle.
2.2 Techniques d'isolement
Isolement en profondeur (technique ancienne)
On utilise une série de géloses VF sans recharger entre elles et sans stériliser la pipette.
Il faut 6 géloses pour une souche pure et 12 pour un mélange.
On préfère aujourd'hui d'autres techniques mais la conservation des souches est ainsi très efficace
sans précautions particulières.
La récupération des bactéries impose de casser stérilement le tube.
L'opération est délicate.
Isolement en surface (technique à utiliser aujourd'hui)
L'isolement se fera sur milieux riches comme la gélose au SANG frais ou la GC + PV.
Il devra être incubé en anaérobiose en jarre.
Isolement sélectif en surface
Des antibiotiques permettent d'assurer une sélectivité à l'isolement :
ex : Kanamycine + Vancomycine pour l'isolement des bacilles gram négatif du genre Bacteroides.
Pour les bactéries sporulées, on peut facilement éliminer les formes végétatives
et les autres bactéries par chauffage 10 minutes à 80 °C.
2.3 Technique pour l'examen microscopique à l'état frais
Une effilure de pipette Pasteur recueille un peu de bouillon étuvé.
On coupe cette pipette et on la place sur une lame.
On obture les extrémités avec de la paraffine fondue.
Cette technique ancienne n'est pas facile à mettre en oeuvre dans des conditions de sécurité
optimales.
Certains auteurs préconisent l'état frais luté tel qu'il était réalisé antan pour toutes les bactéries.
Or le lutage risque de provoquer la formation d'aérosols, chauffe la lame, prend du temps :
la mobilité sera beaucoup plus facile à détecter sur un état frais classique
(bouillon anaérobie) pourvu qu'il soit observé très rapidement.
2.4 Milieux de culture
Considérations générales
Ce sont des bactéries exigeantes : l'apport de facteurs de croissance est nécessaire
en particulier l'hémine ou la vitamine K1 pour certains germes.
Le sang (ou le sang laqué) est donc un bon candidat pour l'enrichissement,
d'autant qu'il apporte la catalase.
L'apport de substances réductrices est utile (cystéine, thioglycolate...) au maintien de l'anaérobiose.
Milieux de base
milieu de Schaedler :
- peptones et extrait de levure
- glucose
- tampon TRIS
- hémine
- Chlorhydrate de L-Cystéine
- Vitamine K3
milieu TGY (trypticase-Glucose-Yeast)
- peptones et extrait de levure
- glucose
- thioglycolate de sodium (réducteur)
milieu VF (viande foie)
milieu VL (viande levure)
Milieux liquides (enrichissement-culture)
bouillon de Schaedler
bouillon VF ou VL
milieu de Rosenow :
- peptones
- chlorhydrate de cystéine
- glucose
- chlorure de sodium
- indicateur d'Andrade (fuchsine acide)
- marbre blanc (carbonate de calcium neutralisant les ions acide)
- morceau de cervelle
La lecture de ce milieu est très empirique : gaz visible par décollement
du bouchon de paraffine, fermentation du glucose (virage au rouge),
réduction du milieu (virage au vert et à l'incolore).
Milieux solides d'isolement
gélose au sang frais (base : Columbia, Schaedler ...)
gélose VF qui reste le miielu de choix pour la conservation des anaérobies strictes.
milieu TSC (Tryptone-Sulfite-Cyclo-sérine)
Ce milieu est utilisé pour l'isolement de Clostridium perfringens des eaux.
- tryptone
- citrate de fer ammoniacal
- disulfite de sodium (générateur de sulfite)
- cyclosérine (antibiotique)
- agar-eau
milieu de Willis
- base columbia
- lactose
- rouge neutre
- émulsion de jaune d'oeuf
- (éventuellement : néomycine pour inhiber les Entérobactéries)
On peut étaler sur une demi-boîte du sérum anti Cl. perfringens
pour inhiber l'action enzymatique.
2.5 Identification
Milieux classiques pour l'identification
- bouillon TY avec addition de glucide ou CTA…
avec problème de réduction de l'indicateur.
Il faut ajouter alors ajouter de l'indicateur le lendemain pour apprécier l'acidification.
Galerie API20A
La galerie API20A est calquée sur la galerie API20E
mais l'inoculation est faite avec un bouillon de Schaedler (additionné de tryptophane)
fortement ensemencé et conditionné sous azote.
L'incubation est anaérobie.
On recherche la fermentation
- de nombreux glucides (indicateur de pH : BCP)
- l'Uréase,
- la production d'indole
- l'hydrolyse de l'Esculine avec un problème de distinction entre H2S et Esculine
que la fluorescence de l'Esculine sous UV permet de résoudre.
- la gélatinase.
Galerie API32 A
Cette galerie est basée sur un inoculum important et une incubation courte et AEROBIE.
Les recherches sont donc essentiellement enzymatiques :
Uréase, ADH, diholosidases, Arylamidases, etc…
Chromatographie en phase gazeuse
La chromatographie en phase gazeuse est utilisée de deux façons en microbiologie
et trouve une application particulièrement importante pour les anaérobies :
- identification et dosage des produits de fermentations
- identification et dosage