Les chlamydia

Plan du chapitre
1 - Contexte clinique
2 - Objectifs
3 - Prélèvements
4 - Méthodes de détection
5 - Interprétation des résultats
 
 

1 . Contexte clinique

Spécialités

2 - Objectifs

La recherche de C, trachomatis s'inscrit dans le cadre :

* du diagnostic étiologique d'une infection génitale symptomatique, haute ou basse, chez l'homne ou la femme,

* du diagnostic étiologique d'une conjonctivite ou d'une pneumopathie néonatale,

* du dépistage des infections génitales asymptomatiques chez l'homme ou la femme dans des circonstances particulières :

- dépistage systématique (loi Calmat, 1990)

- dépistage des personnes à risque (âge compris entre 15 et 20 ans, ayant un comportement à risque, consultant les centres de dépistage anonyme et gratuit des porteurs du VIH)

- bilan d'hypofertilité

* du diagnostic étiologique des arthrites réactionnelles, syndrome de Reiter,

* du suivi d'efficacité thérapeutique.

Pour les infections à C. pneumoniae et C. psittaci, le diagnostic repose en général sur un sérodiagnostic.
 
 

La place de C pneumoniae dans les infections respiratoires est difficile à préciser. Elle varie selon les études, les patients et les pays. C pneumoniae pourrait être à l'origine de 1 0 à 20 % des pneumopathies communautaires.

3 - Prélèvements

1 - Recueil

Conditions générales

Les caractéristiques bactériologiques de ces bactéries expliquent les précautions particulières qu'il convient de prendre pour leur mise en évidence dans un produit pathologique. Le prélèvement doit :

- contenir des cellules
- être mis dans un milieu de transport adéquat
- être fait en dehors de toute antibiothérapie

Matériel

- Ecouvillons pour les prélèvements sur les muqueuses : les écouvillons doivent être adaptés à la technique utilisée. Pour la culture cellulaire, éviter l'écouvillon de coton cytotoxique, préférer les écouvillons à olive plastique pour les femmes et les écouvillons fins en dacron à tige métallique pour les hommes et les prélèvements conjonctivaux.
Les cytobrosses peuvent être utilisées pour le prélèvement endocervical. Elles présentent l'avantage d'être abrasives donc de ramener beaucoup de cellules mais présentent l'inconvénient de provoquer des saignements, à éviter chez la femme enceinte et d'un effet néfaste pour la culture cellulaire.
Les écouvillons doivent être déchargés dans un milieu de transport pour les cultures cellulaires ou le diagnostic par les techniques de biologie moléculaire.
Pour l'examen direct des frottis devant être colorés par des anticorps monoclonaux fluorescents, l'écouvillon doit être déroulé sur une lame et le frottis fixé au méthanol ou l'acétone.

- Un récipient stérile contenant du milieu de transport pour les liquides de ponction (péritonéaux, articulaires) ou les pièces opératoire,
- Un pot stérile pour les urines du premier jet dont la quantité ne doit pas excéder 10 ml.

2 - Site de prélèvements

* Les muqueuses respiratoires : écouvillonnage de gorge, LBA, brosse.

* Les muqueuses génitales : chez la femme, le prélèvement de l'endocol est réalisé après mise en place d'un spéculum et après avoir éliminé la glaire cervicale. Un prélèvement urétral associé est conseillé, les 2 écouvillons pouvant être déposés dans le même milieu de transport.

Avec les techniques d'amplification génique certains prélèvements non conventionnels comme les prélèvements vulvaires ou les pertes vaginales ont été utilisés pour la détection de C. trachomatis et ont donné d'aussi bons résultats que les prélèvements endocervicaux correspondants.

Dans les infections génitales hautes il est possible :

- de réaliser une biopsie d'endomètre à l'aide d'une pince protégée par un cathéter à travers le col

- de pratiquer au cours d'une coelioscopie des prélèvements tubaires (pus, brossage, adhérences) et du liquide dans le cul de sac de Douglas.

Chez l'homme, le prélèvement d'urètre nécessite un écouvillonnage à 3-4 cm du méat. Dans un bilan d'hypofertilité, C trachomatis peut être recherché dans le sperme.

Chez l'homme et la femme, l'urine du premier jet ( < 10 ml) peut être utilisée. Chez la femme, il ne faut pas faire la toilette du méat urinaire et ne pas protéger l'orifice vaginal de manière à souiller les urines par les sécrétions vaginales.

Dans le cas de LGV, on effectue un prélèvement d'ulcérations génitales ou une ponction de l'adénopathie inguinale.

* Les conjonctives : le prélèvement est réalisé à l'aide d'un écouvillon extra fin par un grattage appuyé sur les conjonctives après avoir éliminé les exsudats purulents avec une gaze stérile.

* Les aspirations d'oreille moyenne.

* Les liquides articulaires et biopsies synoviales.

* Les plaques d'athérome.

3- Transport

Un milieu de transport adapté doit être impérativement utilisé. Les écouvillons doivent être déchargés dans un milieu :

- permettant la survie de la bactérie pour la culture cellulaire, comme le 2SP (0,2 M saccharose, 15 mM K 2 HP04,

6 mM K H2 PO4) contenant 5 % de sérum de veau foetal,
 
- ou permettant l'extraction des antigènes ou acides nucléiques pour les autres techniques.

Le délai et la température de transport vont dépendrent de la qualité du milieu, dans le 2SP, le délai de mise en culture ne doit pas excéder 48 h à + 4° (pour un délai plus long, congeler à - 80 °)

Les autres milieux de transport supportent une température ambiante pendant 24 à 48 h et une semaine à + 4 ° C.

4 - Méthodes de détection

A côté de la culture cellulaire, il existe des méthodes rapides de détection des antigènes ou des acides nucléiques.

Toutes les méthodes ne sont pas adaptées à tous les types de prélèvements. La culture cellulaire peut être envisagée quel

que soit le prélèvement mais avec des chances de succès variables dépendantes de nombreux paramètres tels que la

viabilité de la bactérie dans le prélèvement, la nature du prélèvement, la qualité des cellules réceptrices, la qualité de la

révélation.

La plupart des tests rapides n'autorise que recherche de C. trachomatis dans certains prélèvements. Ils sont tous adaptés

aux prélèvements endo-cervicaux, certains également aux prélèvements urétraux masculins. Peu sont adaptés aux

prélèvements conjonctivaux et seules les trousses de biologie moléculaire détectant les acides nucléiques après

amplification permettent de détecter C. trachomatis dans les urines avec une sensibilité correcte.

Pour C. pneumoniae et C. psittaci, il n'existe pas de méthodes commercialisées de détection spécifique d,espèces.

En dehors de la culture et de l'IF immunofluorescence directe) sur frottis, l'amplification génique in vitro est réalisée par

quelques laboratoires spécialisés.

1 - Culture cellulaire

* Les cellules : les plus couramment utilisées sont les cellules McCoy (lignée issue d'une synoviale humaine) et HeLa 229

(lignée issue d'un carcinome du col utérin) pour C. trachomatis et C. psittaci et les cellules HL (issues de poumon

humain) et HEp2 pour C. pneumoniae.

* Le support : plaque pour culture cellulaire à 24 ou 96 puits ou mieux tube individuel contenant

une lamelle

* Les milieux : MEM (milieu essentiel minimum) convient à l'entretien des cellules, supplémenté en glutamine et sérum

de veau foetal.
 
Il peut être additionn, d'antibiotiques et d'antifongiques si nécessaire. Pour la culture des Chlamydia, ce milieu d'entretien est

additionné de glucose (facteur de croissance) et de cycloheximide (bloquant le métabolisme cellulaire).

* Les conditions opératoires : après ensemencement sur les cellules du milieu 2SP contenant le prélèvement, 3 étapes

sont importantes :

* la centrifugation : une vitesse de centrifugation comprise entre 2500 et 3000 g à 35-37 °C pendant 1 heure permet

l'adsorption des corps bactériens sur les cellules,

* l'incubation des cellules en milieu de culture pendant 48 à 72 heures à 37 ° C sous 5 % C02,

* la révélation des inclusions par des anticorps monoclonaux marqués spécifiques de genre ou d'espèce.

La prsence d'une seule inclusion permet d'affirrner l'infection à Chlamydia. Il est recommandé de pratiquer des subcultures

pour augmenter les chances de succès (2 pour C. trachomatis, jusqu'à 5 pour C. pneumoniae).

2 - Méthode de détection des antigènes

* Immunofluorescence directe = IFD

L'IFD est réalisée sur frottis ou sur étalements obtenus par cytocentrifugation. En théorie, elle est possible sur tous les types

de prélèvements mais son interprétation est difficile et tient compte de la qualité des anticorps et de l'expérience de

l'examinateur. Elle permet de visualiser les corps élémentaires (CE) extracellulaires sur un fond cellulaire. Les performances

du test dépendent du réactif utilisé : les anticorps mono-clonaux donnent de meilleures caractéristiques morphologiques, les

anticorps dirigés contre la MOMP (Major Outer Membrane Protein), spécifiques de l'espèce C. trachomatis, produisent

une fluorescence nette et donnent moins de fluorescences non spécifiques que ceux dirigés contre le LPS, spécifiques du

genre Chlamydia.

Le seuil de positivité généralement admis est de 10 CE par frottis. L'IFD est le seul test capable de vérifier la qualité du

prélèvement (richesse en cellules).

* Les techniques immunoenzymatiques EIA et apparentées

Les techniques EIA permettent la détection d'antigènes chlamydiens extraits des prélèvements.

Les trousses autorisées sont validées sur prélèvements endocervicaux, certaines sur les prélèvements urétraux et aucune sur les urines.

L'automatisation de ces techniques et l'absence de subjectivité de lecture constituent un avantage sur I'IFD et les rendent accessibles à tout laboratoire.

* Les techniques de détection des acides nucléiques

Les techniques de biologie moléculaire permettent la détection des acides nucléiques C. trachomatis par hybridation ou par amplification génique (PCR : polymérase chain reaction, LCR: ligase chain reaction, TMA: transcription mediated amplification).

Les tests d'amplification génique commercialisés sont automatisés (PCR, LCR), ou manuels (TMA) et sont capables de détecter C. trachomatis dans les prélèvements génitaux, les urines et le sperme. Ces tests commercialisés ont l'avantage de présenter des qualités de reproductibilité et de sécurité. Ils doivent cependant être réalisés dans les conditions rigoureuses d'organisation,

Certains laboratoires développent leur propre méthode de PCR. C'est actuellement la seule possibilité de diagnostic génotypique pour C. pneumoniae.
 

Différents tests de diagnostic d'une infection à chlamydia 

5 - Interprétation des résultats

1 - Interprétation d'un résultat positif

Pour C. trachomatis, la présence de la bactérie authentifie l'infection causale et entraîne la mise en route d'un traitement adapté. Cependant, il faut connaître les limites de spécificité et les possibilités de faux positifs des méthodes choisies. Pour l'IFD, il faut être exigeant sur la qualité de la fluorescence des CE extracellulaires et retenir le seuil d'au moins de 10 CE par frottis. Pour l'EIA, un test de blocage est indispensable pour confirmer tout résultat positif.

Pour les tests d'amplification, il faut s'entourer de contrôles négatifs. La signification clinique d'un seul résultat positif par amplification génique n'est pas établie.

Pour C. pneumoniae, la relation de cause à effet est encore plus discutable, si le diagnostic repose uniquement sur un résultat de PCR. D'autres arguments cliniques et sérologiques sont nécessaires. Après une infection des voies respiratoires parfois inapparente, un portage à long terme pourrait expliquer la possibilité de réinfection et la dissémination à l'entourage, comme le prouve une forte séro-prévalence dans la population générale. Les tests d'IFD sont particulièrement difficiles à interpréter en raison de nombreux artefacts de fluorescence dûs à la non spécificité des anticorps dirigés contre le LPS du genre Chlamydia.

La mise en évidence de C psittaci dans un contexte clinique évocateur permet de poser le diagnostic.

2 - Interprétation d'un résultait négatif

Pour C. trachomalis, un résultat négatif n'exclut pas le diagnostic, surtout si l'examen a été pratiqué chez une personne symptomatique et à haut risque de MST. Il conviendra en premier lieu de vérifier la qualité du prélèvement et de le refaire pour affirmer ou infirmner le diagnostic. Aucune technique ne possède une sensibilité de 100 % même si les techniques d'amplification tentent de s'en rapprocher. Avec ces dernières, la possibilité de faux négatif n'est jamais exclue du fait de la présence d'inhibiteurs des enzymes de l'amplification dans le prélèvement.

L'utilisation d'un contrôle interne capable de vérifier les étapes de préparation de l'échantillon et d'amplification est indispensable.
 
 

Bibliographie

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