Procédure Opératoire du génotypage du virus de l'Hépatite C (HCV)
Procédure PF6Aq2-3Nomenclature :
Le génotypage du virus de l'hépatite C n'est pas inscrit à la nomenclature des actes de biologie médicale.
I - Prélèvement
A.) Nature et identification
- Prélever sur tube sec (sérum)
- L'identification des tubes primaires est effectuée dans les services au moment du prélèvement
par le personnel infirmier. Des étiquettes sont éditées au laboratoire à l'enregistrement des
demandes d'examen pour permettre de reproduire l'identité des patients sur les aliquotes (tubes
secondaires).
B) Recueil
De préférence, prélever le patient à jeun.
C) Etapes préanalytiques
1) Centrifugation
Centrifuger les tubes primaires dans la centrifugeuse de la pièce de réception pendant 15 minutes à 4 000 trs/minute.
2) Préparation des aliquotes
Aliquoter systématiquement les tubes primaires :
- Prendre des tubes à hémolyse de 5 ml en polypropylène
- Coller sur les tubes les étiquettes d'identification du patient précédemment éditées.
- Transférer le sérum du tube primaire dans le tube en polypropylène lui correspondant.
- Boucher l'aliquote
- Effectuer cette opération patient après patient pour éviter tout risque d'erreur d'identification
- Jeter les tubes primaires dans le conteneur SHARPSAFE jaune pour déchets contaminés de la
pièce de réception.
- Stocker les aliquotes jusqu'à réalisation des analyses dans le congélateur de la pièce SIDA.
D) Etapes analytiques
- Amplification génomique (trousse AMPLICOR HCV ROCHE) : voir procédure opératoire
correspondante
- Hybridation à l'aide de sondes nucléiques (trousse INNO LIPA HCV INNOGENETICS) : se
reporter au chapitre IV Protocole opératoire de la présente procédure
E) Etapes postanalytiques
Conserver les sérums après analyse dans le réfrigérateur à la paillasse pendant une semaine puis les jeter dans le conteneur SHARPSAFE jaune de la paillasse.
Conserver un aliquote sérique en sérothèque à -80°C pendant 1 an au minimum
II - Calibrage
Il n'existe pas de calibrage interne pour cette technique
III - Contrôles de qualité interne
Il n'existe pas de contrôle de qualité interne. Chaque bandelette comporte deux bandes de contrôle de la technique d'hybridation :
- 1 bande contrôle conjugué
- 1 bande contrôle d'amplification
IV - Protocole opératoire
A) Méthode d'analyse
Qualification
Différents articles, abstracts de congrès justifient les performances des trousses.
1) Description et principe
Hybridation après PCR sur une bandelette sensibilisée avec des sondes nucléiques suivie d'une révélation enzymatique (LIPA : LIne - Probe - Assay)
Procédure INNO-LIPA
Hybridation :
- Déposer une bandelette dans une barquette préalablement identifiée
- Ajouter 1 ml de solution d'hybridation préchauffée au bain-marie à 37°C (absence de cristaux)
- Déposer 20 µl d'Amplicon issu de la technique PCR HCV
- Incuber sur l'agitateur Polytest 20 Bioblock à 80 rpm pendant 2 heures à 50°C
- 15 mn avant la fin de l'incubation, préchauffer la solution de lavage stringente à 37°C et
préparer la solution de rinçage par dilution au 5ème de la solution mère dans l'eau distillée
- Veiller à agiter vigoureusement (Vortex) la solution mère
Lavage en condition stringente
- Effectuer pour chaque barquette trois lavages successifs avec 1 ml de solution de lavage ; aspirer
à l'aide de la trompe à vide :
. un 1er lavage de 20 sec
. un 2ème de 30 mn à 50°C : incubation dans l'agitateur
. un 3ème lavage de 20 sec pour terminer
- 10 mn avant la fin du 2ème lavage, préparer la solution de conjugué : diluer la solution mère au
100ème dans le diluant prévu à cet effet et préparer au moins 1 ml de solution diluée pour
chaque bandelette
- Veiller à agiter vigoureusement la solution mère (Vortex)
- Faire 2 rinçages successifs avec un temps de contact de 1 mn en déposant 1 ml de solution de
rinçage diluée par bandelette ; aspirer à l'aide de la trompe à vide.
Addition du conjugué (Streptavidine-phosphatase alcaline)
- Ajouter 1 ml de conjugué dilué dans chaque barquette
- Incuber pendant 30 mn sous agitation à température ambiante
- Préparer le substrat NBT-BCIP par dilution au 100ème dans le tampon substrat ; prévoir au
minimum 1 ml par barquette
- Agiter vigoureusement (Vortex) la solution mère avant de préparer la dilution
Rinçages
- Effectuer pour chaque barquette, 2 rinçages avec 1 ml de solution de rinçage et un 3ème avec
1 ml de tampon substrat
- Temps de contact : 1 mn pour chaque rinçage sous agitation à température ambiante
- Eliminer la solution de tampon substrat par aspiration avec la trompe à vide
Révélation enzymatique : addition du substrat
- Ajouter 1 ml de substrat dilué à chaque barquette
- Incuber pendant 20 mn à température ambiante sous agitation et à l'obscurité (rabattre
le couvercle de l'agitateur)
Arrêt de la réaction
- Eliminer le substrat à l'aide de la trompe à vide
- Rajouter 1 ml d'eau distillée dans chaque barquette
- Placer 10 mn sous agitation à l'obscurité
- Aspirer l'eau distillée avec la trompe à vide et mettre les bandelettes à sécher sur du papier
absorbant
- L'interprétation se fait après séchage complet
2) Obligations techniques prévues dans les arrêtés fixant la nomenclature des actes de biologie médicale
Il n'y a aucune obligation concernant cette analyse qui ne figure pas à la nomenclature
3) Méthode de référence
Il n'existe pas de méthode de référence.
4) Documentation relative à l'analyse
Une notice est disponible dans chaque coffret de réactifs et contient le protocole opératoire propre à la technique.
B) Réactifs utilisés
- Trousse INNO LIPA HCV INNOGENETICS de 20 tests
- N° d'enregistrement à l'Agence du Médicament :
- Les réactifs sont stockés dans le réfrigérateur de la paillasse, la péremption est indiquée par le
fabricant
- Noter la date d'ouverture au marqueur sur le coffret
C) Consommables
- Gants
- Pipettes
- Pipettes graduées de 10 ml
- Embouts sans filtre
- Accuvettes
D) Résultats
1) Validation analytique
Valider chaque bandelette en s'assurant de la réacivité des lignes 1 et 2 correspondant au contrôle conjugué et au contrôle d'amplification
2) Interprétation des résultats
- Comparer la réactivité des bandes d'hybridation avec le masque transparent joint dans le coffret
répertoriant l'ensemble des bandes caractéristiques des types et sous-types génomiques
- Noter les différentes réactivités pour chaque bandelette testée
3) Expression des résultats
En fonction de la réactivité des bandes d'hybridation, déduire le génotypage du virus étudié
Genotype Réactivités obligatoires Réactivités fréquentes
1 Lignes 1 et 2
1a Lignes 3 et/ou 4, Ligne 5
1b Lignes 3 et/ou 4, Ligne 6
2 Ligne 7 et/ou 8 Ligne 5
2a Lignes 7 et/ou 8, Ligne 9 Ligne 5
2b Lignes 7 et/ou 8, Ligne 10 Ligne 5
3a Lignes 11 et/ou 12 et/ou 13
3b Lignes 11, 14 et 15
4a Lignes 14 et 15 ou Ligne 15 Lignes 5 ou 6
5a Ligne 14 Lignes 5 ou 6
4) Saisie des résultats
Il n'y a pas de saisie informatique des résultats qui sont archivés dans le classeur PCR à la paillasse
5) Archivage
Les résultats sont conservés à la paillasse dans le classeur "PCR" situé dans la grande armoire métallique de la sérologie