Procédure PF6Aq2-4

I - Prélèvement

A) Nature et identification

- LCR recueilli par ponction lombaire après fond d'oeil (pour écarter une hypertension

intracrânienne, contre indication formelle à la PL)

- Identification nominative sur les tubes réalisée dans le service au moment du prélèvement

B) Recueil et acheminement

- Recueillir 5 à 10 ml de LCR

- Habituellement dans 3 tubes stériles successifs pour permettre de différencier hémorragie

méningée et prélèvement hémorragique :

. 1 tube est destiné à l'analyse cytobactériologique : généralement le 3ème tube reccueilli

. 1 tube est destiné à la biochimie

. 1 autre tube pour d'éventuels examens complémentaires

- Transmettre rapidement au laboratoire dans du coton cardé, pour préserver la vitalité des

germes éventuellement présents

C) Etape préanalytique

Le LCR ne nécessite un traitement préalable qu'en cas :

- de prélèvement hémorragique : centrifuger 5mn à 4000tr/mn avant de déterminer les chlorures

et la glycorachie. La valeur de la protéinorrachie est dans ce cas faussée par la présence

d'hémoglobine et de protéines plasmatiques

- de recherche d'antigène de cryptocoque : centrifuger 10mn à 4000tr/mn puis désactiver pendant

30 mn au bain-marie à 56°C

D) Etapes analytiques

Se reporter au paragraphe II - Protocole opératoire

E) Etapes postanalytiques

Conserver le LCR pour analyses complémentaires éventuelles :

- Recherche de mycobactéries, électrophorèse, dosage des immunoglobulines : conserver au

réfrigérateur à 4-8°C

- Virologie : congeler à -20°C

II - Protocole opératoire

A) Examen cytobactériologique

L'examen d'un LCR est l'une des deux véritables urgences du laboratoire de Bactériologie-Parasitologie, l'autre étant la recherche de plasmodium.

Les résultats doivent être communiqués au prescripteur le plus rapidement possible.

1) Examen macroscopique

Examiner le tube de prélèvement le plus clair et le plus rempli. Noter l'aspect macroscopique :

- Limpide, eau de roche

- Hémorragique, xanthochromique

- De légèrement trouble à eau de riz

- Purulent

2) Ensemencement

Respecter les conditions rigoureuses d'aseptie (travail à proximité de la flamme)

- Utiliser des géloses préchauffées à 37°C et ensemencer :

. 1 gélose au sang

. 1 gélose chocolat-polyvitex

- A l'aide d'une pipette Pasteur stérile déposer 3 gouttes de LCR à 3 endroits distincts sur chaque

gélose pour faciliter l'interprétation de la culture en cas de contamination

- Mettre les 2 géloses à incuber à 37°C sous CO2 jusqu'au lendemain matin

3) Cytologie

- Homogénéiser le LCR par agitation douce du tube

- Déposer 1 mm3 de LCR dans une cellule de Malassez

- Laisser sédimenter 5 mn

- Compter les éléments sur l'ensemble de la cellule à l'objectif 40 à sec

- Etablir ainsi le nombre d'hématies et de leucocytes présents par mm3

- En cas de doute pour différencier les hématies des leucocytes, on peut ajouter une goutte d'acide

acétique 0,1N sur un bord de la cellule de Malassez provoquant ainsi la lyse des hématies sans

altération des leucocytes

4) Recherches particulières

a) Recherche de cryptocoque

Cette recherche n'est justifiée que pour un patient immunodéprimé. Elle est systématique dans le

cas d'un malade VIH+.

- Technique à l'encre de Chine : suivre le protocole en annexe de la présente procédure

- Mise en évidence d'antigènes cryptococciques : suivre le protocole en annexe de la présente

procédure

b) Culture de mycobactéries

Conserver systématiquement du LCR au réfrigérateur pour transmission au laboratoire de culture

des mycobactéries

c) Culture de virus

Congeler le LCR à - 80°C après examen bactériologique en vue d'une transmission ultérieure au

laboratoire de virologie

5) Résultats

a) Examen macroscopique et cytologie

Les premiers résultats doivent être communiqués sans délai

Conduite à tenir en fonction du nombre de leucocytes par mm3 :

- N < 20/mm3 : communiquer l'aspect macroscopique , le nombre d'hématies et de leucocytes

présents par mm3 et attendre la culture pour les résultats ultérieurs

- N > 20/mm3 : préparer 4 lames pour examen microscopique :

. Déposer 3 gouttes de LCR dans 4 cônes stériles pour cytospin

. Centrifuger pendant 10 mn à 1000tr/mn sur la centrifugeuse cytospin (se reporter à la

procédure de fonctionnement et d'utilisation de la cytospin)

. Sécher rapidement les lames

. Colorer les 4 frottis : 1Gram, 1 MGG, les 2 autres frottis étant destinés aux colorations

éventuelles par le Bleu de Méthylène (pneumocoques) ou par l'Auramine (BK)

b) Examen microscopique

. Réaliser la formule leucocytaire sur le frottis MGG en comptant au moins 100

leucocytes. Signaler la présence éventuelle de cellules atypiques.

. Observer à l'immersion le frottis coloré par le Gram : rechercher la présence éventuelle

de bactéries sur l'ensemble du frottis

c) Culture

Les géloses sont observées le lendemain matin de leur mise en culture.

Les espèces bactériennes les plus fréquemment rencontrées en France, notamment en fonction de l'âge du patient sont mentionnées dans le tableau I.

En fonction de l'âge En fonction du contexte clinique

Nouveau-né : Streptocoque B Traumatisme : Streptocoque sp

Listeria Staphylocoque sp

E coli Klebsielle

Enterobacter

Enfant : Hémophilus Serratia

Méningocoque Pseudomonas

Pneumocoque

Adulte : Pneumocoque Immunodépression : Mycobactéries

Méningocoque

Vieillard : Listeria

Pneumocoque

Attendre 24 heures au minimum pour déclarer une culture négative.

C) Examen biochimique

Se reporter aux fiches opératoires relatives aux paramètres biochimiques concernés

1) Systématiques

Conjointement, en complément à l'examen cytobactériologique, on pratique dans le LCR les dosages :

- du chlore

- du glucose

- et des protides : attention le dosage est faussé dans le cas d'un prélèvement hémorragique

(présence d'hémoglobine et de protéines plasmatiques)

L'interprétation de l'examen biologique du LCR en fonction de la biochimie et de l'examen direct cytobactériologique est résumée dans le tableau II.

LCR normal Méningite purulente Méningite lymphocytaire

Aspect Limpide Trouble, purulent Clair ou

Eau de roche légèrement trouble

Cytologie 1-3 éléments/mm3 1000 à 2000 100 à 300

éléments/mm3 éléments/mm3

Formule Inutile Prédominance de Prédominance de

Poly-neutrophiles Lymphocytes

Glucose 3 à 4 mmol/l 0 à 1 mmol/l Normal (virus)

Abaissé (bactéries)

Protides 0.2 à 0.5 g/l 1 à 5 g/l 1 à 2 g/l

Chlorures 110 à 130 mmol/l Normal Normal sauf tuberculose

(< 110 mmol/l)

Agents

infectieux Absence Méningocoque Virus

Pneumocoque Mycobactéries

Hémophilus Brucelles Streptocoque B Leptospires

Klebsielle Tréponèmes

E. coli Borrelia

Rickettsies

Mycoplasmes

Remarques :

- Le LCR du nouveau-né contient normalement 20 à 30 éléments/mm3 dont 50% de polynucléaires ; la protéinorachie peut être supérieure à 1,5 g/l et la glycorachie entre 2 et 3 mmol/l.

- La glycorachie est toujours normale dans les méningites virales et rarement abaissée au cours des infections à spirochètes (Leptospires, Borrelia, Tréponèmes).

2) Autres paramètres

Les autres paramètres biochimiques éventuellement déterminés sur le LCR sont fonction du contexte clinique. Citons principalement :

- L'électrophorèse des protides

- Le dosage de l'albumine

- Le dosage des immunoglobulines :

. Soit dans le LCR

. Soit simultanément dans le LCR et dans le sérum du patient pour le calcul des différents

index (se reporter aux procédures relatives à ces analyses)