Fiche annexe N° 2

Nomenclature :

Chapitre N° :

Analyse N° :

Coefficient : B70 (pour 2 techniques de dépistage)

A) Méthode d'analyse

Qualification

L'Agence du Médicament, founit la liste des tests sérologiques de dépistage des anticorps anti-HCV dûment autorisés. Il est impératif de se conformer aux instructions officielles, notamment en cas de rappel d'une trousse de réactifs et de bien différencier les réactifs dits de dépistage de ceux relevant de la différenciation.

1) Description et principe

Méthode immunoenzymatique qualitative utilisant des micropuits revêtus de protéines recombinantes et de peptides spécifiques du virus de l'Hépatite C destinée à détecter les anticorps anti-HCV présents dans le sérum.

Le test se déroule en 3 étapes et a pour support réactionnel des micropuits revêtus d'antigènes recombinants spécifiques du HCV. Dans un premier temps, une prise d'essai est diluée directement dans le puit. Si l'anticorps anti-HCV est présent dans le prélèvement, des complexes antigène-anticorps vont se former à la surface du puit après incubation. Dans le cas contraire, aucun complexe ne se fixera et les protéines libres du plasma et du sérum seront éliminées dans l'étape ultérieure de lavage. Durant la deuxième étape, l'anticorps de chèvre anti-IgG humaine marquée à la peroxydase est alors ajoutée et peut se fixer aux IgG spécifiques déjà couplés aux antigènes viraux. Si ces complexes antigène-anticorps sont absents, le conjugué libre est évacué au cours du lavage ultérieur. La troisième étape consiste en l'addition d'un système de détection (OPD-H2O2) entrainant l'apparition d'une coloration révélatrice de la présence d'anticorps anti-HCV. La réaction est stoppée grâce à un réactif stoppant (H2SO4) et la densité optique du mélange réactionnel est lue à l'aide d'un lecteur spectrophotométrique de microplaque en bichromatisme (492 nm - 620 nm). L'intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité de conjugué lié et donc à la quantité d'anticorps anti-HCV liés sur la phase solide.

Suivre le protocole opératoire décrit sur la notice jointe au coffret de réactif.

2) Obligations techniques prévues dans les arrêtés fixant la nomenclature des actes de Biologie médicale

Obligation pour tout sérum de pratiquer une deuxième technique ELISA de dépistage et de vérifier la positivité d'un sérum trouvé positif dans l'une ou l'autre technique par un test de validation.

3) Méthode de référence

Aucune

4) Documentation relative à l'analyse

Une notice est disponible dans chaque coffret de réactif et contient le protocole opératoire propre à la technique

B) Réactifs utilisés

- MONOLISA R anti-HCV SANOFI-PASTEUR de 96 tests unitaires.

- N° d'enregistrement à l'agence du médicament :

- Les réactifs sont stockés dans le réfrigérateur de la paillasse. La péremption est indiquée sur

chaque flacon et sur le coffret.

- Noter la date d'ouverture au marqueur sur le coffret.

C) Consommables

- Embouts de pipettes

- Gants jetables

- Accuvettes

D) Résultats

1) Validation de la microplaque :

DO contrôle négatif : < 0.200

DO contrôle positif : 0.900 < DO < 2,500

Calcul de la valeur seuil :

DO R4

VS = ------

5

DO R4 = moyenne des DO des contrôles positifs.

Les échantillons dont l'absorbance est supérieure ou égale à la valeur seuil sont considérés comme étant positifs (présence d'anticorps anti-HCV)

Ceux dont l'absorbance est inférieure à la valeur seuil sont considérés comme étant négatifs (absence d'anticorps anti-HCV). Il convient cependant de se méfier des échantillons négatifs dont l'absorbance est proche de la valeur seuil.

2) Expression des résultats

La méthode étant qualitative, on considère le sérum comme POSITIF ou NEGATIF en Anticorps anti HCV.

En cas de sérologie de dépistage positive, le compte-rendu d'analyse précise l'obligation d'attendre la confirmation du résultat par un test de validation.

3) Saisie des résultats sur l'informatique GESPOWER

Dans la rubrique "Recherche des anticorps anti-HCV", saisir en toutes lettres :

Négative ou Positive

4) Archivage

Les résultats sont conservés à la paillasse dans le cahier HEPATITE C situé dans la petite armoire métallique de la sérologie. Ils sont également archivés "on-line" et sauvegardés dans le système informatique.