Plan du chapitre
1 - Introduction
2 - Contexte épidémiologique et clinique
3 - Prélèvements microbiologiques
4 - Transport des prélèvements
5 - Examens microbiologiques
6 - Interprétation des résultats
1 - Introduction
Le terme "rickettsies" correspond à un
ensemble hétérogène de bactéries intracellulaires, ayant la structure de bactéries
à Gram négatif, associées à des arthropodes réservoirs et vecteurs.
En pratique, il convient de distinguer les genres Rickettsia, Bartonella,
Coxiella, Ehrlichia; tant du point de vue épidémiologique et clinique que du point
de vue microbiologique.
2 - Contexte épidémiologique et clinique
1 - Rickettsia Orientia
Le genre Rickettsia est composé de bactéries
intra-cellulaires strictes associées à des tiques (groupe boutonneux), à des puces
et à des poux (groupe typhus) et à des thrombiculés (Oriential Rickettsia tsutsugamushi).
Pour le groupe boutonneux, l'infection est évoquée devant une fièvre, éruption,
escarre cutanée, adénomégalie périphérique régionale après piqure de tique, en France
et autour du Bassin Méditerranéen, au Portugal (R. conorii), en Afrique australe
(R. africae), en Amérique (R. rickettsie) et en Europe centrale (R. conorii,
R. slovaca).
Pour le groupe typhus, le diagnostic est évoqué devant un tableau fébrile,
éruption, myalgie, pneumonie et encéphalite dans un contexte de contact avec les rats
et leurs puces (typhus murin ou endémique, R. typhi) ou de prolifération des poux de
corps en cas d'hygiène corporelle et vestimentaire défectueuse en saison froide
(typhus épidémique, R. prowazekii).
Il s'agit essentiellement de pathologie d'importation au retour des Haut-plateaux
d'Afrique (R.prowazekii) et d'Asie du Sud-Est (R. typhi).
Orientia tsutsugamushi est transmise par des trombiculés et se manifeste comme
une pathologie d'importation au retour d'Asie du Sud-Est par un tableau fébrile,
éruptif avec adénomégalie périphérique régionale.
2 - Coxiella
Coxiella burnetii est l'agent intracellulaire
strict de la fièvre Q, zoonose ubiquitaire. L'infection est asymptomatique dans 50 %
des cas et responsable de fièvre isolée, syndrome grippal, pneumonie atypique,
hépatite ou méningo-encéphalite avec contact avec des ovins, caprins, bovins,
chats et chiens.
Les patients porteurs d'une valvulopathie, d'une prothèse valvulaire, d'une
prothèse vasculaire, les femmes enceintes et les patients atteints de néoplasie
peuvent développer une forme chronique à type d'endocardite, infection de prothèse
vasculaire ou ostéite.
3 - Bartonella Afipia fetis
Bartonella spp. et Afipia felis sont des
bactéries intracellulaires facultatives.
Afipia felis a été isolée de ganglions de maladie des griffes du chat mais son
rôle reste controversé.
La recherche de Bartonella spp. est effectuée au cours de la maladie des griffes
du chat (B. henselae) et de syndromes ganglionnaires chroniques (B. quintana),
d'endocardite à hémocultures négatives, (B. quintana, B. henselae, B. elizabethae),
de septicémie chez les patients sans domicile fixe (fièvre des tranchées, B. quintana),
d'angiomatose bacillaire au cours de l'infection VIH, (B. quintana, B. henselae) et
de péliose hépatique au cours de l'infection VIH (B. henselae).
L'alcoolisme chronique et l'absence d'hygiène vestimentaire rencontré
actuellement chez les patients SDF sont des facteurs de risque de l'infection à
B. quintana.
Le contact avec les chats et leurs puces est responsable de l'infection à
B. henselae. B. elizabethae a été isolée chez le rat.
B. bacilliformes est responsable d'une septicémie avec hémolyse (fièvre de Oroya)
et tumeurs cutanées (verruga peruana) et est limitée aux Andes.
4 - Ehrlïchia
Le diagnostic d'ehrlichiose granulomateuse humaine doit être évoqué systématiquement devant tous les patients atteints d'un syndrome arthomyalgique fébrile après exposition ou piqùres de tiques en zone d'endémie de la maladie de Lyme.
3 - Prélèvements
Ces pathologies donnent lieu à un prélèvement de sérum sur tube sec, un deuxième
sérum peut être prêlevé une semaine après le premier. Une hémoculture peut être
prélevée sur tube hépariné.
Au cours des fièvres boutonneuses à Rickettsia, ce
prélèvement est aussi utilisé pour l'immunoséparation des cellules endothéliales
circulantes et l'immunodétection de Rickettsia conorii. Ce prélèvement doit
être congelé à - 20° C pour recherche de Bartonella spp.
Les biopsies (peau, foie, os) et les prélèvements tissulaires (valves natives,
prothèses valvulaires, prothèses vasculaires, placenta) seront recueillis
dans un récipient sec stérile.
4 - Transport des prélèvements
Les prélèvements sont transportés à température ambiante pour un délai de 24 heures, après congélation à - 20° C au delà de ce délai. Le tube de sang pour hémoculture Bartonella spp. doit être transporté congelé dans la carboglace.
5 - Examens bactériologiques
1 - Sérologie
La méthode utilisée est l'immunofluorescence indirecte qui est la méthode de
référence.
Pour Rickettsia lorientia, Coxiella, Ehrlichia, des antigènes obtenus sur culture
cellulaire semi-purifiés par centrifugation sont utilisés.
Coxiella burnetii présente une variation de phase antigénique avec une phase 1
et une phase 2.
Pour Bartonella des antigènes semi-purifiés sur culture cellulaire ou sur
milieu axénique peuvent être utilisés.
La sérologie détecte le titre d'IgT (Ig Totales) et d'IgM. Pour Coxiella
burnetii, le titre d'IgT anti-phase 2 doit être complété par une détermination du
titre IgT, IgM et IgA anti-phase 1, pour un titre d'IgT anti-phase 2 > 1 : 1.600.
2 - Immunodétection
L'immunodétection est possible sur prélèvement tissulaire frais ou fixé et inclus.
Elle est disponible pour la détection de Rickettsia spp. en biopsie cutanée, de .
Coxiella sur placenta, valve cardiaque et anévrisme de Bartonella sur biopsie cutanée,
valve cardiaque et de Ehrlichia sur biopsie ostéomédullaire.
Il est possible de pratiquer une immunodétection de Rickettsia conorii sur les
cellules endothéliales circulantes après leur immunoséparation. Les immunodétections
reposent sur l'utilisation d'anticorps monoclonaux et des techniques
d'immunofluorescence ou d'immuno-peroxydase.
3 - Isolement et culture
L'hémoculture et les prélèvements tissulaires frais sont ensemencés sur 4
tubes-bijou et centrifugés sur culture cellulaire Vero, (Rickettsia, Coxiella),
cellules endothéliales (Bartonella) ou lignée granulocytaire HL 60 (Ehrlichia) ainsi
que sur gélose à 5 % de sang de mouton et gélose BCYE (Bartonella Afipia).
L'ensemencement pour recherche de Bartonella est précédé d'une congélation/
décong&lation du prélèvement. Les milieux sont incubés à 37°C sous une atmosphère
enrichie en 5 % de C02 et conservés 6 semaines. Sur gélose, les colonies de Bartonella
apparaissent en 2 à 6 semaines, l'identification présomptive repose sur l'observation
des bacilles incurvés, à Gram négatif, oxydase et catalase négatives.
En culture cellulaire, Rickettsia et Coxiella peuvent donner un effet
cytopathogène, la recherche de bactérie intracellulaire est effectuée hebdomadairement
après coloration à l'acridine orange et coloration de Gimenez. Les isolats sont mis
en culture cellulaire et cultivés sur gélose pour Bartonella et Afipia.
4 - Identification
L'identification des souches de Bartonella spp. et Afipia spp. est possible par
analyse des acides gras de paroi par chromatographie en phase gazeuse.
Des anticorps monoclonaux sont disponibles pour l'identification des souches de
Ricketisia groupe boutonneux et groupe typhus, Orientia, Ehrlichia et Bartonella spp.
En pratique, ce sont les outils de biologie moléculaire qui apportent
l'identification de certitude, basée sur l'amplification génique (PCR) suivie d'une
analyse des profils de microrestriction ou de séquençage. L'analyse des séquences du
gène de l'ARNr 16S permet d'identifier la plupart des souches.
Les isolats de Rickettsia seront identifiés par l'analyse de la séquence du
gène glta (codant la citrate-synthase) et de rompa (codant l'antigène membranaire
OmpA), les isolats de Bartonella par le gène glta et les souches de Coxiella burnetii
par les gènes sod ou trans. Ces outils peuvent être utilisés pour la détection de ces
bactéries sur des prélèvements uniquement en vue d'orientation diagnostique.
6 - Interprétation des résultats
Concernant les Rickettsia, les résultats de la sérologie sont interprétés dans le
cadre d'un score diagnos.
Au Centre de Référence, un titre en immuno-fluorescence IgG > 1 : 128 et IgM > 1
: 64 est significatif. Au cours de la fièvre boutonneuse méditerranéenne, 100 % des
patients sont séropositifs au 30e jour seulement. Par ailleurs, il existe une
antigénicité croisée entre les espèces du groupe boutonneux et avec le groupe typhus,
rendant l'identification d'espèce impossible par la seule immunofluorescence.
La sérologie par immunofluorescence après absorption croisée du sérum et son
analyse en immunoblot permettent de préciser l'espèce rickettsienne responsable de la
séropositivité. Coxiella burnetii présente une variation de phase antigénique. La
présence d'anticorps anti-phase 2 IgT > 1 : 200, IgM > 1 : 50, signe un contact avec
C burnetii.
La présence d'anticorps IgT anti-phase 2 > 1 : 1.600 ou d'anticorps anti-phase
1 IgG > 1 : 800 traduit une forme chronique d'infection à C burnetii.
Concernant Ehrlichia, le titre signification est en cours de détermination.
Concernant Bartonella, un titre d'IgG > 1 : 200 est significatif; un titre d'IgG
> 1 : 1.600 a une valeur prédictive positive de 90 % dans l'endocardite. Il existe
une variation d'antigénicité des souches de Bartonella henselae. L'isolement
d'une de ces bactéries d'un prélèvement a toujours une signification pathologique
chez l'homme.
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