* l'inactivation génique : le fait d'enlever ou d'annuler
l'expression d'un gène dans un organisme :
EFFET KNOCK-OUT.
Ces deux outils sont basés sur le clonage moléculaire.
* Banque de DNA génomique : donne information sur ce qui
est potentiellement produit dans une cellule quelque soit le type cellulaire.
* Banque de cDNA : ce qui est produit dans une cellule à un
moment donné.
Tout au long de la page on prendra comme exemple : le gène CD4 exprimé au niveau des lymphocytes T CD4+ en molécule de surface CD4 .(corecepteur du TCR).
Fabrication de la banque de cDNA à partir de l'ARNm du LT CD4+ dans un des deux principaux types de vecteurs : plasmides ou phages
Immortaliser la production du fragment de cDNA par le biais d'un vecteur d'expression
( expression d'une proteine codée par l' insert)
- vecteur plasmidique :
* Se reproduit dans une bactérie selon une origine de
replication
* Contient un site multiple de clonage ( MCS) ou polylinker :
série de sites de réstriction uniques qui permettent
d'insérer le cDNA à cloner.
* Un gène de résistance qui permet de
sélectionner les bactéries qui ont intégré ce
plasmide.
* Signaux de transcription et de traduction nécessaires
à l'expression régulée du gène cloné :
un promoteur en 5' de l'insert, un site de polyadénylation en 3' de l'insert.
- Clonage dans un vecteur : Isolation d'un gène entre deux sites de restriction.
Ouvrir le plasmide sur le MCS et y introduire le cDNA par les enzymes de restriction après avoir rajouté des adaptateurs de chaque côté du cDNA double brin, cohésifs avec les sites de restriction du MCS.
Isoler le plasmide contenant le cDNA (CD4) cloné.
* Transfection de la banque dans des cellules COS (cellules fibroblastiques
de rein de singe qui expriment l'antigène T).
* Réplication spécifique des plasmides qui ont
SV40 comme origine de réplication dans des cellules COS.
* Introduction d'une trentaine de plasmides par cellule.
* La transfection est transitoire (épisomique): plasmide dans le
cytoplasme de la cellule non intégré au niveau du chromosome,
ou directe: intégration au hasard de l'ADN plasmidique dans le génome de la cellule.
* Le criblage se fait de deux manières grâce à
l'anticorps anti-CD4 :
- Par CYTOMÉTRIE EN FLUX.
- Par la méthode de BRIAN-SEED (PANNING) :
1 - Utilisation de transfection transitoire dans des cellules COS.
2 - Des boites de Pétri d'anticorps anti-anticorps de souris (IgG) et des boite de cellules COS transfectées transitoirement par une banque de cDNA sont préparées.
3 - Si la banque est complète, on a forcément un plasmide codant pour la protéine d'intérêt CD4 (1pour 1000à 10000 des cellules expriment CD4, dû à la transfection du plasmide codant pour CD4).
4 - On décolle les cellules par traitement à l'EDTA, on les marque par des anticorps de souris anti-CD4 donc les cellules exprimant CD4 auront fixé l'AC à leur surface.
5 - On réalise alors un PANNING : le vecteur est extrait et retransfecté dans des cellules COS, trois à quatre cycles d'enrichissement sont nécessaires à l'obtention d'une population homogène de cellules COS exprimant CD4 à leur surface et donc ayant introduit le plasmide d'intérêt.
Vérifier le bon clonage du gène d'intérêt en faisant une traduction in vitro du cDNA cloné et le comparer au produit du gène dans la cellule d'origine par IMMUNOPRECIPITATION et WESTERN-BLOT.
0.1.4.2. Northern-blot
Le gène cloné est utilisé comme sonde CD4 sur l'ARNm de LT CD4+ ou CD4-.
0.1.4.3. Antisérum
* Purifier la protéine CD4 recombinante et
soluble.
* Séquençage de la protéine en nucléotides et
choisir le bon cadre de lecture correspondant à une trentaine
d'amino-acides.
* Synthétiser le peptide et l'injecter sous forme lyophilisée
dans un lapin.
* Récolter l'antisérum dirigé contre le peptide
(anticorps anti-CD4).
* Faire un western-blot avec la protéine CD4 d'origine.
0.1.4.4. Transfection
Introduction de DNA dans une cellule eucaryote (visualiser la transfection de la cellule COS par le plasmide d'intérêt en immunofluorescence par AC anti-CD4).
A différencier de :
* Transformation : introduction de DNA dans une bactérie.
* Transgénèse: introduction de DNA dans un oeuf
fécondé.
* Transduction : introduction de DNA dans une cellule quelconque
quand le vecteur est un rétrovirus.
Identificaton du chromosome qui contient le gène d'intérêt.
- Où se trouve physiquement le gène cloné ?
* Repérer les chromosomes de lymphocytes en culture au moment de la
mitose.
* Faire un caryotype en métaphase.
* Hybridation de la sonde radioactive, qui correspond au gène CD4
cloné, avec le DNA homologue.
* On détermine dans le chromosome la position du gène.
- Dans quels buts ?
* Maladies génétiques dans cette région du
génome : certaines régions du génome sont favorables aux
translocations et aux remaniements chromosomiques par recombinaison qui
entrainent la production de protéines nouvelles (protéines de
fusion) qui sont responsables de pathologies tumorales.
* Le gène cloné peut donc servir à la
thérapeutique.
DEFINITION : introduction d'un DNA exogène (transgène) dans un oeuf fécondé.
PRINCIPE : introduction d'un gène soit dans un organisme qui ne l'a pas, soit pour amplifier ou pour transformer un gène endogène par le biais d'un vecteur de transgénèse contenant le transgène cloné.
* Le vecteur de transgénèse est un vecteur classique
plasmidique linéarisé et débarrassé des
séquences procaryotes non importantes pour la transfection et
néfastes à l'organisme transfecté.
* La transgénèse sous promoteur exogène: on
introduit le gène en 3' d'un promoteur exogène c'est à
dire appartenant au vecteur de transgénèse. On peut donc exprimer
ce gène dans n'importe quelle cellule: contrôle spatio-temporel de
l'expression du gène.
* La transgénèse sous promoteur endogène: le
gène inséré est sous le contrôle de son propre
promoteur: l'expression est la même que dans la cellule où le
gène est normalement exprimé (même type de
régulation).
* On croise un mâle et une femelle de souris superovulée (par
des hormones).
* Le lendemain les oeufs fécondés sont prélevés
dans l'oviducte de la souris mère.
* Maintenir l'oeuf à l'aide du capillaire de maintient.
* Injecter le DNA physiquement grâce à un micromanipulateur
(sous microscope), traverser la membrane pellucide et rentrer le DNA dans le
pronucleus mâle (transfection stable de l'oeuf fécondé).
* Remettre cet oeuf fécondé dans l'utérus d'une souris
pseudogestante, pour que la nidation puisse se faire.
* Donner naissance à des souriceaux transgéniques (1 sur 10
en général).
Vérification de l'intégration du transgène:
* L'ADN génomique est isolé à partir d'un
fragment de queue de souriceaux.
* Analyse en southern-blot : on fait une digestion par des
endonucléases de restriction, une électrophorèse sur gel
d'agarose et une hybridation avec une sonde spécifique du DNA
injecté, après transfert sur nitrocellulose.
On voit ainsi s'il y a eu intégration ou pas.
Exemple : Si le transgène code pour une molécule de surface (CD4) la mise en évidence de l'intégration se fera par immunofluorescence avec l'AC anti-CD4.
* Analyse en PCR : c'est la méthode la plus
sensible actuellement pour détecter la présence d'un
transgène par l'utilisation d'une amorce qui lui est spécifique
(la réaction d'amplification n'a lieu que si l'ADN exogène s'est
inséré dans la séquence endogène).
Le phénotype conféré par le DNA exogène se traduit par un changement phénotypique ou l'apport d'un nouveau phénotype.
Le niveau d'expression du transgène dépend:
* Du nombre de copies (les copies s'intègrent en tandem,
visible en southern-blot)
* De son lieu d'intégration.
* De son promoteur.
L'injection du transgène dans le pronucleus mâle donne des souris transgéniques hétérozygotes +/-. En faisant plusieurs croisement, on pourra obtenir des lignées transgéniques homozygotes +/+.
Cela revient à enlever un gène (le contraire de la trangénèse).
Etudier le devenir du système immunitaire en l'absence d'un gène, au niveau developpement et fonction = Modèle d'étude de l'implication du gène dans une maladie, par inactivation génique
* Générer des clones de cellules ES isolées de
blastocyste
- Dilutions limites (une cellule par puit).
- Rajouter des cellules nourricières (feeder) en monocouche.
* Obtenir des amas de cellules ES en clone qui dérive d'une seule
cellule ES originelle.
On prend comme exemple de gène cible sur la cellule ES, le gène CD3 - [epsilon] (qui contient 8 exons et qui code pour le module de transduction du TCR ).
* Il est très important de connaître la structure
génomique que l'on veut inactiver.
* Effectuer un ciblage génique grâce à la
transfection de cellules ES par un vecteur de remplacement : qui est une
construction de 5 à 10 kb d'homologie en 5' et d'une mutation stop en 3'
du gène CD3 - [epsilon] (on n'aura jamais transcription du
gène en entier) puis recombinaison homologue avec le gène
endogène ,d'où modification du DNA génomique de la souris
de façon définitive.
* Autres vecteurs de ciblage : Ce sont des vecteurs de remplacement
portant le gène d'intérêt muté par remplacement d'un
exon trés important ( exon 5) par un gène Néo qui
confère à la cellule une résistance à la
néomycine :selection + (mutagénèse d'insertion).
Et une selection _ par la présence du gène de la thymidine kinase TK ( du virus HSV-1) sensible à un produit antiviral : le gancyclovir qui est mis en 3' du gène d'intérêt.
- Si la recombinaison est non homologue : la cellule transfectée est résistante à Néo et sensible au gancyclovir.
- Si la recombinaison est homologue : la cellule transfectée est résistante à Néo et résistante au gancyclovir.
* Ciblage génique utilisant la recombinase bactérienne
site spécifique : CRE :
- Inactivation génique complète du gène CD3 - [epsilon] par délétion de ses exons 5,6,7et 8.
- Remplacement par les gènes de sélection Néo et TK entourés de séquences LoxP de même orientation (au niveau du vecteur).
- Elimination de ces gènes de sélection aprés l'évènement de recombinaison homologue avec l'ADN génomique , grâce à l'action de la proteine CRE qui laisse qu'un seul LoxP au niveau du gène CD3 - [epsilon] muté.
* Vérification de la transfection : on détermine la
différence de taille entre l'allèle muté et
l'allèle endogène de façon à pouvoir les distinguer
par southern-blot ou par PCR
On va donc obtenir un gène muté sur un de ces allèles car la probabilité de trouver cela sur deux allèles est trés faible (1/106).
* Transfecter des cellule ES avec un vecteur de ciblage qui provoque une
mutation par recombinaison homologue et inactive un allèle du
gène cible a ( a+/a- ).
* Les sélectionner.
* Réinjecter ces cellules ayant le phénotype
altéré dans un blastocyste qui est réimplanté dans
un utérus de souris pseudogravide (manipulation sous microscope).
* Au niveau du blastocyste il y'a une notion de territoir :
- certains territoirs auront pour cellules formatrices des cellules ES a+/a-.
- D'autres territoirs auront pour cellules formatrices des cellules ES a+/a+.
Ce qui donnera un animal de peau chimérique.
* Le degré de chimérisme est déterminé à
partir du % de cellules ES a+/a- des descendants.
* Mais il n'y a pas forcément une corrélation stricte entre
le chimérisme de la peau et celui des organes.
* La transmission germinale se fait par colonisation de la lignée
germinale par les cellules ES a+/a- . Si mâle : spermatozoide a+ et
spermatozoide a-
Si femèle : ovule a+ et ovule a-
* Vérifier le phénotype de souriceaux issus du croisement de
souris chimériques +/- ou +/+
( voir si la transmission germinale s'est réellement faite ) par analyse du DNA extrait de la queue en PCR ou southern blot.
* Pouvoir croiser les souris et perpétuer l'inactivation du
gène jusqu'a obtenir une souris K.O: a-/a- dont les deux allèles
sont mutés (+,-) x ( +,-) = 100% (+, - ) qui donne 1/4 (+, -) ;
1/2 (+,-) ; 1/4 (-,-)
* Contrecarrer la léthalité des souris double K.O. pour
véritablement connaitre le rôle du gène inactivé : -
par transgènése couplée à une technique de K.O.
- Par reconstitution du système immunitaire dans une souris déja K.O.
On prend comme exemple une souris K.O. pour le gène de la DNA pol B dans les lymphocytes T :
* Générer une souris double K.O. sur les deux allèles
du gène transformés par recombinaison homologue avec LoxP
flanquants sans faire agir CRE .
Si CRE agit = double K.O.
* Générer des souris transgéniques pour le gène
de la proteine CRE qui est exprimé sous promoteur spécifique
inductible que dans les cellules T.
* Croiser les deux souris et obtenir en F2 :
- des souris K.0. pour le gène en question au niveau des cellules T.
- des souris normales pour le gène au niveau des autres cellules.
* Contrôle externe : le hasard du croisement fait qu'une
cellule T ne reçoive pas le transgène parmi d'autres cellules T.
* Contrôle interne :promoteur inductible que dans les cellules
T parmi les autres cellules.
RAG -/- .
* Les gènes RAG 1 et RAG 2 : codent pour des enzymes qui permettent
de faire des réarangements de gènes VDJ au niveau des cellules T
et B du système immunitaire : générer de la
divérsité.
* On peut faire des souris K.O. pour RAG 1 = RAG 1 -/-
ou pour RAG 2 = RAG 2 -/-
ces souris sont immunodéfiscientes = pas de maturation de lymphocytes T ni B.
* Reconstitution du système immunitaire par des lymphocytes K.O.
pour les 2 allèles d'un gène a = (a-/-) : en réinjectant
des cellules ES (a-/-) dans un blastocyste issu de croisement de souris RAG
-/-.
Injection du blastocyste à une mère porteuse et analyse du phénotype des souriceaux.
( Obtenir des clones ES (a-/-) en augmentant la quantité de néomycine dans le milieu ).
* Obtenir des souris chimères qui ont un système immunitaire
issu de cellules ES = (a-/-)
et (RAG +/+ ) donc notion de territoirs = cellules T (a-/-)
cellules B (a-/-)
autres cellules (RAG -/-).
- Antigène purifié
- Peptides synthétiques
- Protéines de fusion
- le plus souvent à la souris
- au moins 3 injections
Fusion des splénocytes de la souris immunisée avec un myélome murin (plasmocytome) non sécréteur
- Sélection des hybridomes sécrétant un ou plusieurs anticorps spécifiques de l'antigène
- Le plus souvent : ELISA +++
Cytométrie de flux +
- Dilutions successives permettant d'obtenir un seul clone produisant donc un anticorps et un seul.
- Production d'ascite chez la souris
- Culture cellulaire à grande échelle
- Concentration en Ac possible par précipitation au sulfate d'ammonium
- Purification par chromatographie d'affinité sur une colonne de billes couplées soit à la protéine A ou G, soit à l'antigène.
Technique utilisant des plaques à 96 puits le plus souvent en PVC
- Immobilisation de l'antigène
- Saturation des sites non spécifiques
- Incubation avec un Ac ou le surnageant d'hybridome
- Incubation avec un anticorps anti- Ac de souris couplé à une enzyme
- Révélation enzymatique
- Immobilisation de l'Ac 1
- Saturation des sites non spécifiques
- Incubation avec un l'antigène
- Incubation avec l'Ac 2 soit marqué, soit d'un isotype différent de l'Ac 1
- Si l'Ac 2 est marqué ---> révélation
- Si l'Ac 2 n'est pas marqué ---> incubation avec un anticorps anti-isotype marqué dirigé contre l'isotype de l'Ac 2, puis étape de révélation
- Si les deux Ac reconnaissent le même épitope ou des épitopes contigus, la fixation du premier Ac sur l'antigène va interdire ou diminuer la fixation du second Ac
SDS= sodium dodecyl sulfate PAGE= PolyAcrylaimde Gel Electrophoresis
Cette migration en gel SDS-PAGE permet de séparer des protéines en fonction de leur poids moléculaire. En effet, le SDS est un détergent anionique qui va dénaturer les protéines et leur conférer une forte charge négative. Les protéines présentant une même charge négative migreront non plus en fonction de leur pHi mais en fonction de leur poids moléculaire.
Avant la migration, les protéines peuvent être traitées par un agent réducteur (ß-mercaptoéthanol ou dithiothréitol DTT) pour dissocier les sous-unités liées par des ponts disulfures.
Après migration, les bandes protéiques sont visualisées par coloration du gel au bleu de Coomassie (sensibilité = 1 ug) ou au nitrate d'argent (plus sensible 1 à 10 ng). La taille des bandes est déterminée par comparaison à un marqueur de poids moléculaire connus.
Après séparation de protéines sur gel SDS-PAGE, les bandes protéiques sont transférées sur un support solide comme des membranes de nitrocellulose ou de nylon. Les bandes protéiques peuvent être colorées sur la membrane par coloration réversible au rouge Ponceau (moins sensible que la coloration au bleu de Coomassie)
Suit une étape d'immunorévélation (saturation, incubation avec un Ac marqué par ex., puis révélation) qui permet de déterminer quel bande protéique est reconnue par un anticorps monoclonal ou un sérum polyclonal.
Du fait de la dénaturation de la protéine de nombreux anticorps monoclonaux ( à la différence des anticorps polyclonaux) sont inutilisables en Western-Blot par non reconnaissance de la protéine dénaturée.
Cette technique peut permettre de déterminer la présence et la quantité d'antigène et permet de mettre en évidence des interactions protéine-protéine
On introduit dans le milieu de culture un acide aminé marqué radioactivement comme la méthionine S35 qui peut s'incorporer dans toutes les synthèses protéiques de novo.
- Marquage des protéines membranaires sur les résidus tyrosine.
- Méthode la plus utilisée pour les protéines membranaires qui sont peu abondantes et plus difficiles à mettre en évidence par marquage métabolique
- Les techniques de lyse cellulaire les plus fréquentes utilisent des tampons contenant des détergents qui vont solubiliser les protéines.
- Les détergents peuvent être classée en détergent ionique comme le SDS et en détergents non ioniques comme le triton, le NP40, la digitonine et le Brij96 (du plus détergent vers le moins)
- Compromis entre :
une solubilisation suffisante de l'antigène
le maintien de la reconnaissance de l'antigène par l'anticorps
la non dissociation de complexes protéiques que l'on veut mettre en évidence
- Incubation du lysat avec l'anticorps
- Fixation des complexes Ag-Ac par les billes de protéine A qui vont se lier au fragment Fc de l'anticorps du complexe.
- Dissociation des complexes dans un tampon de charge contenant du SDS
- Séparation des constituants des complexes par migration sur SDS-PAGE
- La révélation peut se faire par autoradiographie si les protéines ont été préalablement marquées ou par Western-Blot.
- Le microséquençage permet de déterminer la séquence amino-terminale d'une protéine inconnue
- Cette technique nécessite au moins 10 picomoles de protéines, soit au minimum 109 cellules
- On réalise une dégradation d'Edman qui consiste en des dégradations successives de l'amino-acide N-terminal. Le profil de chaque amino-acide libéré est étudié par spectrophotométrie
- Nécessité d'une extrémité N-terminale non bloquée. Arrêt possible à cause de la glycosylation
- La réaction ne se faisant pas à 100% l'analyse est limitée à environ 50 amino-acides
- Si problème, coupure enzymatique de la protéine (trypsine, chymotrypsine) et purification par HPLC des peptides sur lesquels seront réalisés de nouvelles dégradation d'Edman.
- Incubation avec un anticorps marqué à un fluorochrome (fluorescéine, phycoerythrine)
- Excitation à une certaine longueur d'onde
- Lecture au microscope à fluorescence
- Avantages: matériel nécessaire moins onéreux / cytométrie de flux
-Inconvénients: lecture sur environ 100 cellules
pas de réelle quantification possible
- Cette technique permet de donner des informations sur chaque cellule passant individuellement dans une gaine liquide devant un faisceau laser. Ces informations portent sur la taille de la cellule et sur sa granulométrie. De plus, si les cellules ont été incubées avec un anticorps marqué à un fluorochrome, il est possible de visualiser les populations cellulaires marquées et non marquées et de quantifier ce marquage. Il est possible de réaliser des doubles ou des triples marquages en utilisant 2 ou 3 Ac marqués par des fluorochromes différents.
- Inconvénients: matériel onéreux / IF sur lame
- Avantages: lecture sur plusieurs dizaines de milliers de cellules
quantification possible
possibilité de tri cellulaire