Les organismes vivants existent car ils peuvent réaliser des mouvements cellulaires coordonnés. Il existe deux manières de guider les cellules :
* haptotaxie : guidage par adhésivité du substrat. Les cellules se déplacent
vers les régions qu'elles préfèrent.
* chimiotactisme : déplacement des cellules en réponse à un gradient de
concentration d'une substance = effet chimioattracteur. Dans certains cas,
la cellule se déplace vers la région où la concentration est élevée, on
parle alors de chimiotactisme positif. Dans d'autres cas, la cellule se
déplace vers la région où la concentration en substance est faible, on parle
alors de chimiotactisme négatif.
L'effet chimioattracteur est différent de l'effet chimiocinétique où il y a accélération du mouvement des cellules sans les orienter.
Pour savoir comment le chimiotactisme fonctionne, on étudie les granulocytes.
Exp. : détermination de la morphologie des cellules en mouvement.
- dépôt d'une goutte de sang sur une lame de microscope
- coagulation
- les leucocytes adhèrent à la lame (en majorite des granulocytes neutrophiles)
- lavage
- mise en place de la lamelle
- analyse microscopique : les cellules sont arrondies et ne se déplacent pas
D'un côté de la lamelle, on ajoute une substance chimioattractive; celle-ci diffuse et crée un gradient de concentration. Trés rapidement, les cellules se déforment et ont un aspect caractéristique de cellules en mouvement: aspect asymétrique avec formation d'un lamellipode en avant et d'un uropode à l'arrière
Le lamellipode est d'épaisseur inférieure à 1 um et contient peu ou pas d'organelles. S'il y en a, ces organelles sont immobiles car un réseau cytosquelettique polymérisé les empêche de bouger (alors que ce réseau est dépolymérisé au niveau de l'uropode).
La cellule envoie le lamellipode en avant et s'attache. Ensuite elle se contracte et se détache à l'arrière.
Pour vérifier que le lamellipode est attaché à l'avant, on étudie les contacts en microscopie à interférence-réflexion. Principe : on envoie un rayon lumineux sous le lamellipode.Au voisinage de l'interface verre/membrane, on a deux réflexions qui ont une différence de phase de [pi]. Si la distance entre la membrane et le verre est nulle, la lumière réfléchie est minimum et la région sombre obtenue correspond à un accolement physique appelé '"focal contact".
Lorsque l'on fait cette étude avec les granulocytes, on observe des régions sombres; donc la cellule s'attache bien à l'avant.
Autres expériences pour préciser comment se déforme la cellule :
* expériences de flux de particules membranaires: on dépose des particules
membranaires sur des cellules en mouvement et on regarde comment elles s'adaptent.
On obtient des résultats variables: les particules sont immobiles, ou se
déplacent vers l'avant, ou se déplacent vers l'arrière. Cette expérience
ne permet donc pas de déterminer le mécanisme du mouvement.
* analyse des trajectoires: dire que la cellule distingue la droite de la
gauche, c'est dire qu'elle est assez grande pour que, dans un gradient de
concentration, on puisse voir une différence de concentration d'un côté
et de l'autre de la cellule. La cellule peut se diriger quand la diffÈrence
est de 2%.
Cas des bactéries: elles se déplacent en général grâce à un flagelle qui les dirige en ligne droite. Ces périodes de déplacement sont espacées par des périodes rotatoires où la direction change de manière aléatoire = phénomène de tumbling. La bactérie mesure la concentration moyenne autour d'elle toutes les secondes :
- si elle augmente, le tumbling devient plus rare (la bactérie va dans la bonne direction)
- si elle diminue, le tumbling augmente. Le changement de direction est plus fréquent.
Cas des cellules : elles sont sensibles à un gradient de concentration spatial (alors qu'il est temporel chez les bactéries). Si les granulocytes sentent une augmentation de concentration, ils se dirigent tous dans la même direction.
Les cellules tournent beaucoup moins que les bactéries (angles plus petits) et ne vont jamais dans la direction opposée. Elles sont polarisées.
Principe: on sépare un compartiment liquide par un filtre dont les pores ont un diamètre de quelques microns. Dans le compartiment inférieur, on place une substance chimiotactique. Dans le compartiment supérieur, on place la suspension de cellules. La substance diffuse et les cellules vont être attirées.
Mesure du chimiotactisme :
* on utilise des cellules marquées et on compte combien passent à travers
le filtre
* ou: on rend le filtre transparent et on regarde au microscope jusqu'à
quelle distance les cellules ont migré.
Principe : on coule un gel d'agarose sur une lame de verre. On fait des trous de 10 ml sur trois niveaux. Dans le 1er niveau, on dépose la substance chimiotactique, dans le 2ème on dépose les cellules et dans le 3ème le milieu. Les cellules sédimentent au fond du puit. Si elles sont sensibles au gradient, elles passent sous l'agarose et migrent.
Mesure du chimiotactisme : on mesure la distance de migration des cellules vers la substance chimiotactique et vers le milieu.
Dans la chambre de Boyden, on tient compte de la capacité de déformation de la cellule et de son déplacement dans un milieu à trois dimensions. Dans la migration sous agarose, on fait intervenir la capacité d'adhésion de la cellule.
Comparaison dans des conditions pathologiques :
ex 1: syndrome de Chediak Higashi (neutrophiles contenant des granules géants). Les neutrophiles sont peu déformables et migrent mal dans la chambre de Boyden. Par contre leur migration sous agarose est normale.
ex 2 : syndrome LAD (Leucocyte Adhesion Defficiency). Les leucocytes ne migrent pas sous agarose mais se déplacent bien dans la chambre de Boyden.
Les cellules phagocytaires peuvent être attirées directement par les bactéries. Le chimiotactisme des substances bactériennes est dû à la présence de formyl méthionine, placée sur les peptides lors de l'initiation de leur synthèse (ce qui n'est pas le cas chez les eucaryotes).
Des expériences de stimulation des phagocytes ont montré que le motif formyl met leu phe (FMLP) était trés bien reconnu, et ce avec une forte affinité (1 nM)
La phagocytose permet l'élimination des produits altérés de l'organisme (cellules mortes) et des agents étrangers.
Exp de RESSIS: étude de l'élimination des hématies altérées. Dés que l'hématie est altérée, en voie de dégradation, elle libère des facteurs chimiotactiques qui attirent les phagocytes. Ce sont les produits nécrotaxiques.
Ce sont des substances chimiotactiques libérées en grand nombre par les cellules immunitaires. Elles sont formées de 70 aa et sont reconnues par des récepteurs qui ont des analogies de structure (récepteurs des grandes protéines G à 7 segments transmembranaires). Elles sont classées en deux familles et ont des spécificités un peu différentes :
* CC (2 cystéines proches): attraction des monocytes et des lymphocytes
* CXC : attraction des granulocytes.
ex : IL-8, MIP I, II, III (Macrophage Inflammatory Protein), MCP (Monocyte Chemoattractant Protein), RANTES (restreint aux thymocytes normaux activés, exprimée et sécrétée).
Les chémokines ont souvent une action double :
* à faible concentration, elles sont chimioattractives
* à forte concentration, elles induisent la sécrétion de facteurs cytotoxiques
par les cellules phagocytaires.
Ils sont de deux types :
* fragments protéiques trés réactifs qui s'accrochent ex : C3b
* fragments protéiques circulants ex : C5a
Il est libéré en cas d'hypersensibilité.
La concentration en facteurs chimiotactiques varie trés vite à partir du point d''émission. Pour qu'une cellule se déplace dans le gradient, il faut que tous ces récepteurs ne soient pas occupés. La cellule doit donc adapter sa sensibilité de reconnaissance en fonction de la concentration: il y a un phénomène de régulation.
Quand la cellule est activée le nombre de récepteurs augmente. On obtient ce même résultat quand on stimule par le PMA. Il s'agit d'une régulation positive.
Les cellules s'activent en plusieurs temps: chez le sujet non infecté, la cellule est peu réactive. Aprés la première stimulation, plus on augmente les doses, plus elle le deviendra.
Quand la cellule est désactivée, les récepteurs sont éliminés par endocytose et leur nombre diminue. On parle de "down regulation".
Les récepteurs ont affinité qui varie de 0,1 à 25 nM.
Chez les cellules au repos, les récepteurs ont une haute affinité. On peut induire le passage à faible affinité en ajoutant du GTP-[gamma]S (analogue du GTP non hydrolysable).
Exp : on traite les récepteurs avec IL-8 ou PMA aprés avoir injecté du GTP radioactif. On mesure la quantité de GTP fixée au récepteur. Quand on fait une 2ème stimulation, il y a un découplage du récepteur et du GTP: même si le récepteur fixe son ligand, il n'y a plus de fixation du GTP. C'est un phénomène de désensibilisation.
Quand une cellule est stimulée, elle produit un lamellipode dans une direction donnée. Plusieurs hypothèses sont émises pour ce mécanisme :
* rôle de la concentration ionique-phénomène osmotique: dans un milieu hypertonique,
il n'y a plus de formation d'un lamellipode.
On stimule une cellule par une substance chimiotactique et on crée ainsi une augmentation de la pression osmotique à l'endroit de la stimulation. En effet, la fixation du ligand sur le récepteur entraine la dissociation de complexes moléculaires (libération de Ca2+, phosphates ...). L'augmentation de la pression provoque une entrée d'eau à travers la membrane et crée une force qui entraine la membrane en avant.
* mécanisme actine/myosine: dans le lamellipode, il y a des faisceaux d'actine
parallèles à la direction. Le glissement actine/myosine pousserait le lamellipode
en avant.
Exp. de THERIOT et MITCHISON: on fait entrer dans la cellule des dérivés de l'actine que l'on peut rendre fluorescents. On illumine une petite région et on observe au microscope: la barre fluorescente devrait se déplacer, or ce n'est pas le cas. Cela va donc contre l'hypothèse du glissement actine/myosine.
* polymérisation d'actine : l'extrémité + des filaments d'actine, permettant
leur polymérisation, est à l'avant. Cela pousserait la membrane à l'avant.
Problème: comment la molécule d'actine G peut s'insérer entre le polymère et la membrane ?
Hypothèse: la membrane se met à battre par fluctuation thermique et se détache du polymère d'actine. La molécule d'actine G pourrait donc s'insérer.
Pour se déplacer, la cellule doit se détacher. Ce détachement à l'arrière peut-être dû aux récepteurs dont l'affinité est modulable : quand l'affinité diminue, la cellule se détache.
On a l'impression qu'il existe une force de traction car les cellules perdent des fragments de membrane quand elles se détachent.
Exp. de HORWITZ : on perméabilise les cellules et on induit ainsi des forces de traction qui reproduisent le détachement. Dans la cellule, cette force est produite par les complexes actine-myosine.
Importance de la myosine II : les mutants Myo II - sont trés ralentis car ils ne peuvent pas se détacher.
La phagocytose est universelle. Cela correspond à l'ingestion d'une particule par une cellule.
But des phagocytoses :
* éliminer les débris cellulaires (rôle trés important)
* éliminer les bactéries et les agents infectieux
On met une population phagocytaire en présence de bactéries. Aprés incubation, les bactéries sont concentrées au niveau des phagocytes :
* soit dans les cellules
* soit collées à la surface
Pour distinguer les deux, on essaye de détacher les bactéries collées à la surface avec des enzymes ou des chélateurs de Ca2+. Cela ne marche pas car la fixation est irréversible. On cherche donc d'autres procédés :
* lyse des particules par Ac+complément+: les bactéries extracellulaires
sont lysées, les bactéries intracellulaires ne le sont pas. Quand une bactérie
est ingérée, elle est protégée de l'extérieur. C'est le phagocyte qui
la lyse.
* utilisation de la propriété de certains facteurs de décroitre dans le
milieu extracellulaire; ex : la fluorescéine diminue quand elle est en milieu
acide. On fait le test à pH neutre et à pH acide.
Les coupes sont suffisamment fines pour voir les mécanismes de phagocytose. Il en existe deux :
* la particule à ingérer entourée d'Ac est présentée à un
phagocyte. Celui-ci envoie des lamellipodes qui entourent la particule et forment une vacuole,
ou phagosome, où elle sera lysée.
* le phagocyte, en présence d'une particule à ingérer, va former un puit
dans lequel la particule va síinsérer. Le puit se referme autour d'elle
pour former un phagosome.
Remarque : le schéma de la phagocytose varie en fonction du type de particule à lyser.
* à 37deg.C, le processus de la phagocytose est un phénomène explosif. La
vitesse d'ingestion est de 0,5 sec/mm2
* à température ambiante, la vitesse est de 8 sec/mm2
Le processus de phagocytose dépend donc de la température.
Si on bloque le Ca2+ intracytoplasmique, on bloque ou non la phagocytose. Si on utilise des inhibiteurs métaboliques, leur efficacité varie selon les particules.
Les résultats dépendent du type de particules mis en jeu.
Il y a au moins une centaine de récepteurs à la surface du phagocyte
Les bactéries hydrophobes sont celles qui sont phagocytées le plus facilement.
Technique de VAN OSS pour mesurer l'hydrophobicité d'une bactérie: (schéma 14.5)
les bactéries sont déposées sur un support. On ajoute une goutte d'eau. Si les bactéries sont hydrophiles, la goutte d'eau s'étale. On a alors un angle de 150deg.. Si les bactéries sont hydrophobes, la goutte d'eau reste en suspension et on a un angle de 70deg..
Il y a donc un parallèle entre phagocytose et hydrophobicité.
Il existe deux stratégies pour éviter la destruction d'une bactérie:
* éviter la phagocytose
* provoquer une phagocytose plus rapide et se maintenir dans la cellule.
Les bactéries semblent avoir compris ce mécanisme et se couvrent d'une capsule
riche en glycoprotéines (hydrophobes). La phagocytose se fera plus rapidement
et les bactéries se maintiendront dans la cellule.
ex: mycobactéries (responsables de la tuberculose): l'angle formé par la goutte d'eau est de 70deg..
Ce sont des récepteurs pour les sucres, en particulier le mannose et le fructose. Les bactéries sont capables de produire des capsules avec des sucres non reconnus par ces récepteurs. Mais le système immunitaire entre en action: intervention des Ig G, Ig A et Ig E.
Exp.: on infecte une souris par le pneumocoque.
Si la souris est normale, le pneumocoque avec ou sans capsule est détruit. Par contre, si la souris est rendue tolérante pour les polysaccharides de la capsule, elle meurt.
Soit C3b est activé par une réaction Ag/Ac.
Soit C3b est activé spontanément par la bactérie.
Il y en a plusieurs :
* Fc[gamma]RI, II, III
* CD64 (haute affinité)
* CD 32 (moyenne affinité)
* CD 16 (moyenne affinité)
Importance des récepteurs de moyenne affinité: le phagocyte a ses récepteurs de haute affinité saturés par les Ac. Quand un Ac spécifique de la bactérie arrive à la surface, l'attachement se fait grâce aux récepteurs de basse affinité.
La reconnaissance est de deux types :
* reconnaissance de la phosphatidyl sérine: les lipides sont distribués
de façon symétrique dans les membranes. En général, la PS est sur la membrane
interne mais quand la cellule est morte, elle peut passer sur la membrane
externe.
* reconnaissance de la vitronectine = constituant extracellulaire se fixant
sur les cellules mortes.
* Le modèle de la fermeture éclair ou "zipper" de GRIFFIN et SILVERSTEIN:
pour être phagocytée la particule doit adhérer sur toute sa surface, elle
doit donc être recouverte de molécules d'adhésion.
Exp.: on recouvre partiellement ou totalement des lymphocytes B par des Ac. Dans le 1er cas, ils ne seront pas phagocytés. Dans le 2ème cas ils le seront.
Il faut donc qu'il y ait des molécules d'adhésion sur toute la surface.
* Opsonines:ce sont toutes les substances qui rendent les particules phagocytables.
* Limite de la phagocytose: chaque fois qu'une particule est phagocytée,
le phagocyte perd une partie de sa membrane.
La cellule préserve les constituants qui lui sont utiles, par exemple le système de transport des acides aminés. Il y a un tri des molécules de membrane.
* La phagocytose est phénomène actif: elle peut être inhibée par la colchicine
qui bloque la polymérisation des microtubules.
Il existe plusieurs mécanismes pour détruire la particule phagocytée:
Elle est due à des ATPases qui pompent les protons du cytosol vers la particule. Le pH passe de 7 à 5 en quelques minutes.
Certaines bactéries poussent à pH neutre mais pas à pH 5: elles seront détruites.
Certains parasites se développent mieux à pH acide (ex: leischmanie): problème!
Certains virus ont besoin de l'acidification pour changer la conformation de leur capsule. Ils passent alors dans le cytosol en fusionnant avec la membrane du phagosome: problème!
Le lysosome, rempli d'enzymes lytiques, doit arriver au contact du phagosome pour qu'il y ait fusion.
Dans les granulocytes, il existe quatre populations qui fusionnent avec des cinétiques variées. Cette différence vient de la composition en enzyme+: certaines sont actives à pH neutre donc la fusion sera rapide. D'autres enzymes sont actives à pH acide donc la fusion se fera plus tardivement.
Certaines bactéries peuvent inhiber cette fusion (ex: toxoplasme).
Les dérivés sont obtenus par réduction de l'O2 en anion superoxyde (O2-) puis en peroxyde (H2O2) avec production de radicaux libres.
Intérêt théorique: cette réponse oxydative est bien étudiée du point de vue moléculaire.
Quand la particule est phagocytée, il y a activation d'enzymes membranaires qui vont produire des constituants s'associant en un complexe oxydase. Il y aura donc production d'O2- de façon rapide.
Intérêt pratique: quand le système est défectueux, il n'y a pas de réponse oxydative. Cela provoque une granulomatose fatale (ou chronique) qui est une maladie trés grave.
Effet bactéricide: l'O2- n'est pas bactéricide. L'H2O2, à faible concentration, ne l'est pas non plus. Pour qu'il y ait une action bactéricide, il faut une peroxydase (qui vient du phagocyte) et des ions halogénures. Ils vont former des hypochlorites (ClO-) et permettre la chloration des bactéries. La réponse oxydative est trés rapide et peut donc se faire par différentes voies. Mais si les agents infectieux ont une catalase, ces réactions n'ont pas lieu.
Dérivé du monoxyde d'azote: la production de dérivé de monoxyde d'azote semble être un mécanisme essentiel de destruction de parasites murins. L'importance de ce mécanisme chez l'homme n'a pas été démontrée.
La fonction essentielle de la phagocytose est la défense; c'est souvent un mécanisme décisif.
L'équilibre entre cellules phagocytaires et bactéries dépend de l'activation ou non de la phagocytose. Cette activation se fait par l'intermédiaire de l'interféron [gamma] (IFN [gamma]) produit par les lymphocytes T.
Les sujets qui guérissent produisent de l'IFN [gamma] ou ont des macrophages qui y répondent mieux.