Cette page présente brièvement la technique d'hybridation fluorescente (FISH), ou fluorescent in situ hybridization, destinée à repérer la présence de molécules cibles par un système couplé anticorps-fluorophore.
La détection de séquences nucléotidiques sur une molécule d'ADN peignée sur une surface s'effectue indirectement, par hybridation des séquences d'ADN recherchées ( les sondes) sur l'ADN peigné ( ou ADN matrice ou cible ). Si les sondes sont préparées de manière à incorporer des marqueurs fluorescents ou des sites de reconnaissance antigéniques ou autres, il est possible de visualiser par microscopie d'épifluorescence la position respective des sondes, ce qui constitue l'objectif de la cartographie physique.
Les sondes elles-mêmes sont réalisées séparément suivant différents protocoles possibles, tous basés sur la reconstitution d'un brin d'ADN comportant des nucléotides modifiés, à partir d'un brin matrice de départ.
La technique de random priming généralement utilisée,
consiste ainsi à polymériser le brin complémentaire entre des hexamères de monobrin (brins
composés de six nucléotides aléatoires), suivant le principe habituel.
L'enzyme polymérase synthétise le brin complémentaire N entre l'hexamère 1 et l'hexamère 2, qui se sont appariés au brin matrice M, en incorporant les nucléotides marqués présents en solution.
L'hybridation est l'étape de mise en présence des sondes avec les molécules d'ADN peignées. L'ADN cible est au préalable dénaturé, c'est-à-dire qu'il subit un traitement censé séparer partiellement les deux brins constitutifs de la molécule, découvrant ainsi des portions de simple brin.
Les sondes elles-mêmes sont également dénaturées , ce qui a pour résultat dans leur cas, de séparer complétement les monobrins.
Les sondes viennent alors spontanément s'apparier avec les séquences complémentaires présentes sur l'ADN peigné.
La révélation est l'étape finale de l'hybridation fluorescente. Elle consiste à faire reconnaître les sondes par des anticorps flanqués de sites moléculaires fluorescent, ou bien, dans le cas du système biotine-avidine , à juxtaposer plusieurs couches de ces molécules modifées par des sites fluorescents.
Schématiquement, un brin d' ADN matrice dénaturé , et une séquence sonde hybridée. La sonde comporte quelques nucléotides modifiés par la présence d'une molécule de biotine , auxquelles viennent se lier des molécules de streptavidine possédant un site fluorescent. Ces molécules sont elles-mêmes reconnues par des anticorps anti-avidine "équipés" d'un site biotine et d'un site fluorescent (ou fluorophore ). On peut alors poursuivre la construction et procéder à une révélation constituée de plusieurs couches ou sandwichs de révélation.
L'observation des séquences hybridées s'effectue à l'aide d'un microscope à épifluorescence, qui éclaire l'échantillon avec une lumière de longueur d'onde assez spécifique, et récupére la lumière émise par les sites fluorescent, en général de longueur d'onde supérieure, ce qui permet de n'observer que les sites hybridés.
A l'aide de jeux de filtres optiques, il est ainsi possible d'observer plusieurs fluorophores aux caractéristiques optiques différentes, et donc de distinguer entre sondes hybridées sur le même brin d'ADN.