Plan du chapitre

1 - Contextes identifiés

2 - Objectifs

3 - Difficultés de recueil : contamination salivaire

4 - Pnenmopathies communautaires

5 - Pneumopathies nosocomiales sous ventilation artificielle

6 - Pneumopathies à germes opportunistes chez l'immunodéprimé

7 - Pneumopathies atypiques

8 - Recherche de Bordetella

9 - Recherche de Nocardia

10 - Mucoviscidose

Pneumopathies communautaires

Pneumopathies nosocomiales sous ventilation artificielle

Pneumopathie atypiques

Pneumopathies chez l'immunodéprimé

Mucoviscidose

Surinfections bronchiques (BPCO)

+++ à rechercher dans tous les cas
++ à rechercher dans des circonstances particulières
+ à rechercher de façon exceptionnelle

* Identifier la ou les bactéries en cause.

* Différencier les bactéries commensales des bactéries patogènes.

* Etudier la sensibilité aux agents antimicrobiens

* Rechercher une colonisation, surveillance épidémiologique.

* Identifier certains critères pronostics (pauci-cellularité, bactérie muqueuse).

* Participer au suivi thérapeutique.

De nombreuses espèces microbiennes responsables d'infections pleuropulmonaires peuvent être présentes

à l'état commensal dans l'oropharynx et la salive.

Ce sont notamment :

Haemophilus influenzae,

Une attention extrême doit être portée aux conditions de recueil de ces prélèvements.

Il faut éviter la présence de salive qui risque de diluer la flore pathogène et de la contaminer par des

bactéries conunensales.

Sont considérées comme bactéries salivaires :

staphylocoques à coagulase négative,

streptocoques autres que S. pneumoniae,

corynéformes,

Neisseria commensales.

Pour remédier à cet écueil important, plusieurs mesures sont préconisées :

* éliminer les prélèvements dont l'examen microscopique montre une contamination salivaire évidente;

* procéder à une analyse quantitative de la flore bactérienne;

* recueillir les sécrétions pulmonaires des malades ayant une pneumopathie grave au moyen de méthodes invasives mais plus fiables : brossage bronchique protégé et lavage broncho-alvéolaire.

Pour éviter la pullulation des bactéries commensales aux dépens de bactéries fragiles comme

S. pneumoniae, le prélèvement doit être acheminé rapidement au laboratoire.

Dans les pneumopathies graves, l'examen bactériologique des sécrétions pulmonaires est complété

utilement par la pratique d'hémocultures et éventuellement par l'examen du liquide pleural. l

Les antibiotiques modifiant les flores, il est fondamental de recueillir les sécrétions bronchopulmonaires

avant le début du traitement antibiotique si cela est possible.

cier le degr‚ de contamination par la salive. Elle

* Pour certains auteurs l'examen bactériologique du crachat en routine doit être proscrit.

* Il ne doit pas retarder la mise en route du traitement probabiliste.

* Plus de 90 % de ces infections sont dues à un nombre limité d'espèces bactériennes à savoir :

- Streptococcus pneumoniae,

- Haemophilus influenzae,

- Mycoplasma pneumoniae,

- Legionella pneumopbila,

- Chlamydia pneumoniae.

* Ces résultats sont aléatoires en raison de la contamination salivaire.

* Le traitement antibiotique de première intention est prescrit de façon probabiliste en fonction de critères épidémiologiques.

* Ses indications sont alors limités aux suppurations bronchiques réfractaire.

* Les pneumopathies qui s'aggravent sous traitement justifient une hospitalisation et la mise en oeuvre de méthodes invasives visant notamment à mettre en évidence une Legionella (voir ci-dessous).

* Pour d'autres auteurs les indications sont moins restrictives. Cet examen a une valeur

informative à condition que :

1) le recueil de l'expectoration soit de bonne qualité;

2) la qualité du prélèvement soit confirmée par l'examen microscopique;

3) une signification clinique soit accordée uniquement à l'espèce prédominante si elle atteint ou dépasse le seuil

de 10 7 bactéries/ml.

Le recueil de l'expectoration doit respecter un protocole rigoureux : il doit se faire le matin, au réveil, après

rinçage bucco-dentaire à l'eau distillée stérile et lors d'un effort de toux aidé, si besoin d'une kinésithérapie.

L'examen bactériologique doit être effectué sans délai.

La technique suivie, décrite par Bartlett et adaptée par Murray et Washington, permet d'apprécier le degré de contamination par la salive. Elleconsiste à examiner soit à l'état frais, soit un frottis coloré par la méthode de

Gram au microscope à grossissement x 1 00 et à dénombrer en faisant une moyenne sur 1 0 champs les cellules

épithéliales et les leucocytes par champ (après vérification de la morphologie à un grossissement plus fort).

Les résultats de l'examen microscopique permettent de distinguer 5 classes de crachats :

Classe	Cellules par champ
	Epithéliales	Leucocytes
1	> 25	< 10
2	> 25	10 - 25
3	> 25	> 25
4	10 - 25	> 25
5	< 10	> 25

La présence de macrophages alvéolaires est le témoin de l'origine basse des sécrétions.

Les crachats de classe 1 et 2 sont fortement contaminés par la salive. Ils ne sont pas utilisable pour la culture.

Un autre prélèvement est à demander.

Les crachats de classe 3, 4 ont un nombre de leucocytes qui témoigne d'une réaction inflammatoire mais sont contaminés par la salive.

Les crachats de classe 5 sont les plus appropriés pour l'examen bactériologique.

Ceux de classe 4 sont acceptables.

Après fluidification du prélèvement on ensemence une dilution appropriée permettant un dénombrement des bactéries au delà de 105 UFC/ml sur :

* gélose chocolat enrichie (5 à 10 % de C02) avec ou sans bacitracine

* gélose au sang

* gélose sélective pour les bacilles à Gram -

Habituellement on se limite à l'identification et à l'antibiogramme d'une ou deux espèces bactériennes en quantité

> ou = à 10 7 bactéries par ml.

- Elles sont fréquentes : 10 à 30 % des malades sous respirateur.

- Elles sont graves : mortalité 20 à 50 %.

- L'isolement des micro-organismes en cause est la clé du traitement.

1 - Principales espèces responsables

Ce sont les bacilles à Gram négatif (BGN) pour 60 % des cas et les staphylocoques pour 40 % des

cas. Dans un tiers des cas, il s'agit d'une infection polymicrobienne.

* Les BGN sont par ordre de fréquence

- Pseudomonas aeruginosa

- Acinetobacter baumannii

-Klebsiella - Enterobacter - Serratia

* Les staphylocoques sont Staphylococcus aureus (30 %) et aussi S. epidermidis (10 %).

* Les Candida spp. sont trouvés avec une fréquence croissante, jusqu'à 10 % des cas.

* Parmi les autres espèces, citons :

- S. pneumoniae et H. influenzas, au cours de pneumopathies nosocomiales précoces

(moins de 5 jours d'hospitalisation) ;

- les bactéries anaérobies dont la fréquence est probablement sous estimée et dont l'incidence

est importante lors des pneumopathies de déglutition;

- Legionella pneumophila.

Le diagnostic microbiologique le plus fiable d'une pneumopathie nosocomiale est assuré par l'association :

- d'une culture quantitative à partir d'un prélèvement endobronchique protégé distal et dirigé vers la lésion;

- de 1' examen cytobactériologique des sécrétions issues de poumon profond.

Trois techniques de recueil des sécrétions sont utilisées couramment :

- le brossage bronchique protégé (BBP),

- le lavage broncho-alvéolaire (LBA),

- l'aspiration endotrachéale (AET).

La BBP est la méthode de référence pour établir le diagnostic de pneumonie. Lorsque BBP et LBA sont

associés, la sensibilité et la spécificité de ces examens dépassent 90 %. Ces examens invasifs permet-

tent d'orienter le traitement antibiotique.

L'AET est pratiquée si les deux méthodes invasives ne sont pas réalisables notamment chez le nourrisson.

Chez l'adulte, elle a essentiellement une valeur prédictive négative.

* La référence demeure le dispositif de Wimberley constitué d'une brosse en nylon fixée à l'extrémité d'un guide métallique. Brosse et guide coulissent à l'intérieur d'un premier cathéter, lui-même placé à l'intérieur d'un second cathéter, obturé par un bouchon de polyéthylène glycol.

* Cette brosse télescopique est glissée au travers d'un fibroscope et dirigée sous contrôle de la vue

dans une petite bronche de 4e ordre drainant le territoire pulmonaire radiologiquement suspect.

Le cathéter interne est alors poussé, expulsant le bouchon et permettant d'avancer la brosse de

quelques centimètres, pour réaliser le prélèvement bactériologique.

* Après cela les manoeuvres inverses sont effectuées : on désinfecte alors la partie externe du cathéter interne par de l'alcool à 90'C, puis on fait sortir la brosse interne et on la coupe avec des ciseaux stériles pour qu'elle tombe dans

1 ml de liquide (eau physiologique tamponnée stérile ou liquide de Ringer) que l'on agite sur place au lit du malade (agitation mécanique de type vortex) pendant 2 min. Le prélèvement est apporté sans délai au laboratoire.

* Après avoir prélevé la quantité nécessaire à la culture on réalise une coloration de Gram sur le culot de centrifugation. La culture quantitative s'effectue dans les conditions décrites plus haut.

* Un seuil de 103 UFC/ml est considéré comme significatif. La sensibilité et la spécificité sont de l'ordre de 70 % c'est à dire qu'il est observé environ 30 % de faux négatifs.

* Le seuil de significativité peut être abaissé à moins de 5.10 2 UFC/ml notamment chez les malades recevant des antibiotiques. Chez ces malades un dénombrement bactérien < 10 3 UFC/ml ne peut éliminer le diagnostic d'infection pulmonaire.

* La technique consiste à instiller après blocage du bronchofibroscope dans une bronche segmentaire ou sous-segmentaire des échantillons de 50 ml de sérum physiologique (à 37'C) 4 à 6 fois et on ramène entre 20 et 60 % de la quantité injectée.

* Le LBA a plusieurs avantages : possibilité d'examen microscopique du culot de centrifugation du liquide, exploration d'un territoire pulmonaire plus important que le BBP, recueil d'une plus grande quantité de sécrétions.

* Chez les malades intubés et ventilés, suspects de pneumonie nosocomiale, la concordance entre

BBP et LBA est de 90 % environ.

* Cette méthode de prélèvement est particulièrement utile pour le diagnostic des pneumopathies

observées chez les immunodéprimés et perrnet de rechercher : des bactéries (Nocardia, Legionella, mycobactéries, Mycoplasma pneumoniae, Actinomyces) mais également des virus (Cytomegalovirus, Herpes), des parasites

(Pneumocystis carinii), des champignons et levures (Aspergillus, Cryptococcus, Candida).

* Le traitement des échantillons consistera à :

- centrifuger 30 à 40 ml de liquide dans un tube conique stérile à 5000 tours pendant 10 minutes;

- à partir du culot, faire des frottis et procéder aux colorations suivantes : Gram, Ziehl-Neelsen

(Gram-Weigert ou Gomori-Grocott pour la recherche de Pneumocystis), immunofluorescence directe pour la recherche de Legionella.

La prise en compte et la numération des cellules (> … 7 %) du lavage broncho-alvéolaire contenant des bactéries

intracellulaires permettrait de prédire dès l'examen direct l'existence d'une pneumopathie bactérienne chez les

malades ventilés.

* Les cultures et le dénombrement sont réalisés dans les conditions indiquées plus haut.

* Un dénombrement des germes banaux supérieur à 10.4 UFC/ml est généralement considéré

comme signitif d'une pneumonie.

5 - Aspiration endotréchéale (AET)

L'aspiration des sécrétions par la son d'intubation est une méthode alternative lorsque les méthodes

invasive sont contre-indiquées. Le risque de contamination par la flore bucco-salivaire est important.

Différents critères d'acceptabilité du prélèvement sont proposés.

* Chez l'adulte, après coloration de Gram ne sont mis en culture que les prélèvements contenant des

bactéries visibles au microscope (grossissement x 1000) ou contenant moins de 10 cellules épithéliales

par champ microscopique ( grassissement).

* Chez l'enfant, le seul critère permettant de rejeter un prélèvement est l'absence de bactéries après

coloration de Gram (grossissement x 1000).

de la contamination par la flore oropharyngée.

Les micro-organismes à rechercher sont :

- Pneumocystis carinii

l'oro-pharynx postérieur.

* Pneumopathie néonatale : recherche de Chlamydia trachomatis dans les aspirations naso-pharyngées

ou la gorge.

le recueil des sécrétions doit être réalisé par brossage endo-bronchique ou lavage broncho-alvéolaire.

* Recherche de Legionella dans les sécrétions recueillies par brossage endo-bronchique ou lavage broncho-alvéolaire par IFD sur le culot et par culture sur BCYE alpha additionné d'antibiotiques. L'incubation se poursuit durant 10 jours avec une observation joumalière à la loupe binoculaire. La recherche de Legionella par amplification est réalisée dans certains laboratoires principalerinent sur les LBA, de même que la recherche précoce d'antigènes urinaires.

La majeure partie des cas de coqueluche observés en France le sont chez des enfants de moins de 2 ans ou chez des adultes anciennement vaccinés qui peuvent faire des formes atypiques de la maladie.

* Le prélèvement doit être le plus précoce possible, ce qui est difficile en dehors d'un contexte épidémique.

Recueilli par aspiration nasopharingée postérieure, il est acheminé au laboratoire dans les 2 heures à température ambiante.

* L'immunofluorescence directe manque de sensibilité et de spécificité. Elle n'est pas recommandée.

* La culture est une méthode délicate, spécifique mais peu sensible. Elle s'effectue sur milieu de Bordet et Gengou ou sur milieu de Reagan et Lowe au charbon additionné de 15 à 20 % de sang de cheval ou de mouton, additionné ou

non de céphalexine. B. pertussis se développe après incubation à 37'C pendant 4 à 6 jours.

* La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) est spécifique et sensible, mais elle n'est pas disponible en routine.

* La recherche de l'adénylate cyclase sécrétées par B. pertussis est une méthode qui a une bonne sensibilité, mais une spécificité moyenne. Intéressante par sa rapidité, elle vient en complément de la culture.

Elle s'effectue principalement sur les LBA. L'examen direct après coloration de Gram peut montrer des bacilles à Gram positif ramifiés. Une coloration de Ziehl à froid est conseillée. La culture est réalisée sur gélose au sang incubée pendant 20 jours. L'identification complète est confiée à un laboratoire spécialisé.

patients atteints de mucoviscidose ont été publiées par un groupe de travail spécifique.

Ces recommandations sont reproduites ci-dessous.

E. Bingen, G. Chabanon, J.P. Flandrois, N. Marty,

M. de Montclos, H. Monteil, B. Pangon, P. Plésiat,

V. Vernet, M. Weber

Coordonnateur: B. Pangon

La mucoviscidose est une maladie chronique dont l'une des principales manifestations est la survenue

d'infections respiratoires. Au cours des épisodes infectieux, le clinicien ne décide pas de la thérapeutique

ou de ses modifications sur des critères uniquement cliniques. Il a besoin pour l'aider dans sa décision

d'un prélèvement microbiologique accompli selon des règles rigoureuses et interprétées de façon homogène.

Pour la recherche d'une meilleure qualité des soins, il est apparu nécessaire d'établir des recommandations

portant sur l'analyse bactériologique de l'expectoration. Ces recommandations concement la qualification

des prélèvements, le seuil de dénombrement des différentes espèces, les milieux de culture et l'antibiogramme.

l - Critères de qualité des prélèvements

La qualité du prélèvement est évaluée par la coloration de Gram selon les critères microscopiques habituels : rapport entre le nombre de polynucléaires neutrophiles et le nombre de cellules épithéliales pharyngées.

La flore bactérienne présente est décrite.

Les échantillons ne répondant pas aux critères de qualité (absence de polynucléaires neutrophiles) ne

sont pas considérés comme impropre à l'analyse. Mais la mauvaise qualité du prélèvement doit être

signalée afin qu'un autre échantillon soit éventuellement adressé au laboratoire.

Les échantillons sont homogénéisés dans une solution de fluidificateur pour expectorations et un

dénombrement est réalisé selon les critères suivants :

* Pour les patients dont le diagnostic de mucoviscidose est récent et pour lesquels la colonisation à

P. aeruginosa n'est pas connue :

* Le seuil inférieur de dénombrement doit être de 10 2 UFC/ml pour P. aeruginosa et B. cepacia.

* Le seuil inférieur de dénombrement doit être de 10 5 UFC/ml pour les espèces n'appartenant pas à

la flore commensale : bacilles à Gram négatif type Entérobactéries ou non fermentants et pour les

3 espèces pathogènes suivantes appartenant aussi à la flore saprophyte S. aureus, H. influenzas, S pneumoniae.

* Pour les patients dont le diagnostic de mucoviscidose est plus ancien : c'est-à-dire dont la colonisation à .

P aeruginosa est connue :

- Le seuil inférieur de dénombrement doit être de 10 2 UFC/ml pour B. cepacia.

- Le seuil inférieur de dénombrement doit être de 10 5 UF.C/ml pour les espèces n'appartenant pas à la flore commensale : bacilles à Gram négatif type Entérobactéries ou non fermentants y compris P. aeruginosa et pour

les 3 espèces pathogènes suivantes appartenant aussi à la flore commensale : S. aureus, H. influenzas,

S. pneumoniae.

La sérotypie de P. aeruginosa est de peu d'apport (beaucoup de souches ne sont pas typables). En revanche, la description du caractère muqueux ou non des souches est d'un réel apport pour le clinicien.

Les prélèvements doivent être ensemencés au minimum sur les milieux suivants :

* Gélose nutritive permettant la croissance de S. pneumoniae, S. aureus et S pyogènes.

.

* Gélose nutritive permettant la croissance de Haemophilus.

* Gélose sélective permettant la croissance de bacilles à Gram négatif et plus particulièrement P. aeruginosa et B. cepacia.

* Gélose permettant la croissance de champignons (Candida, Aspergillus).

Tous les milieux sont incubés 48 à 72 heures à 37'C après une première observation à 24 heures.

Dans l'état actuel de nos connaissances, la recherche de mycobactéries ne semble pas devoir être systématisée

en dehors d'un contexte clinique particulier.

* Un antibiogramme restreint est réalisé avec recherche de bêtalactamase pour :

- Haemophilus influenzae.

- Moraxella catarrhalis.

* Un antibiogramme pour les cocci à Gram positif : S. aureus, S. pneumoniae.

* Un antibiogramme pour les bacilles à Gram négatif :

- Pour chaque morphotype dominant de P. aeruginosa.

- Pour B. cepacia.

- Pour les autres bacilles à Gram négatif non fermentants (S. maltophilia, A. xylosoxidans).

- Certaines molécules ne doivent pas être oubliées : ticarcilline, ceftazidime, aztréonam, imipénème, tobramycine, amikacine,

- D'autres molécules peuvent être testées : ticarcilline + ac. clavulanique, pipéracilline + tazobactam, céfépime, moxalactam, cotrimoxazole, isépamicine.

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