Microbiologie des écosystèmes

La compréhension de la Microbiologie des Ecosystèmes est une démarche trop souvent négligée. L'interaction Bactériologie, Virologie, Parasitologie (Ecologie du Parasitisme) sont étroitement liés.

Il faut approfondir la recherche fondamentale à visée appliquée sur les microorganismes présents dans des écosystèmes tels que le tube digestif, les muqueuses, les aliments, l'eau et l'air. Le rôle de chacun et les dangers des déséquilibres devraient inciter à plus de recherches cognitives.

Si la thématique générale est articulée autour de la détection, l'identification et la persistance de microorganismes potentiellement pathogènes dans l'environnement et de l'impact qu'ils peuvent avoir sur la santé humaine ou animale, le laboratoire de Bactériologie doit s'intéresse également au rôle protecteur de la flore intestinale dominante, constituée essentiellement de bactéries anaérobies, au rôle essentiellement protecteur de l'entérocyte, la flore sous-dominante, esssentiellement les entérobatéries non pathogène en quantité normale, qui effectue une grande part de la dégradation des résidus végéraux, entre autres, au lieu de concentrer la totalité de ses efforts sur la flore dominée que sont les bactéries pathogènes pour l'homme; la flore lactique du vagin sont parmi les exemples les plus représentatifs.

La Microbiologie des Ecosystèmes a vu se développer des liens fructueux entre laboratoires de Parasitologie et le service d'Hygiène.

Le laboratoire de Virologie tiendra compte de la qualité des eaux de surface et de l'étude des entérovirus associés aux entérites, cardiomyopathies ...

Le laboratoire de Bactériologie doit créer et développer une synergie avec les services de Gastro-entérologie.

Le développement souhaitable de la Microbiologie des Ecosystèmes devrait pouvoir contribuer à une meilleure appréhention des maladies infectieuses et du déséquilibre parfois important qui mal contrôlé peut conduire à des situations lourdes de conséquences ... vaches folles etc ... avec pour thématiques "Immunité muqueuse et cutanée", "Epidémiologie et contrôle des pathogènes de l'environnement".

Thèmes abordés :

I - Bactériologie

Vaginite - aspect général

II - Ecologie du parasitisme

Mycoses vulvo vaginales

III - Virologie

I - Bactériologie

Applications vaccinales et probiotiques des bactéries lactiques

Les bactéries lactiques, en particulier les levains laitiers, sont bien connues pour leur utilisation en industrie agroalimentaire.
Elles sont, à ce titre, consommées quasi-quotidiennement depuis des millénaires et reconnues comme non-pathogènes par excellence.
Une autre caractéristique de ces microorganismes, ayant retenu l'attention des chercheurs depuis plusieurs décennies, est l'effet bénéfique qu'elles peuvent exercer en santé humaine ou animale (effet probiotique). Plusieurs propriétés leur ont été attribuées, dont certaines ne sont que partiellement étayées par des données expérimentales rigoureusement contrôlées.
Leur rôle bénéfique a néanmoins été clairement établi dans le problème d'intolérance du lactose et dans le maintien d'une microflore équilibrée dans des cavités corporelles telles que le tractus gastro-intestinal ou urogénital. Certaines souches de lactobacilles en particulier sont capables de coloniser l'intestin, le vagin ou la cavité buccale de l'homme et des animaux, y limitant le développement de microorganismes pathogènes.

Cette situation a conduit récemment à l'idée d'évaluer le potentiel des bactéries lactiques, comme auxiliaires vivants de vaccination. La nécessité toujours actuelle de développer des vaccins plus sûrs, faciles à administrer et peu onéreux, a conduit à une recherche intensive sur l'utilisation potentielle d'organismes vivants recombinants comme vecteurs d'antigènes protecteurs, administrables en particulier par voie(s) locale(s).
Le rôle exercé par la composante mucosale dans la réaction de défense d'un individu vis-à-vis d'un agent pathogène est considéré comme critique dans le cas de plusieurs maladies infectieuses.
Les muqueuses constituent en effet la porte d'entrée de la plupart des virus ou bactéries pathogènes à l'origine d'infections respiratoires, intestinales ou urogénitales.
Le développement de moyens efficaces pour stimuler une réponse immunitaire mucosale permettant de neutraliser l'agent pathogène à son point d'entrée dans l'organisme, constitue donc un axe prioritaire de recherche en vaccinologie aujourd'hui.

Cette situation a motivé la recherche d'un système vaccinal sûr et original. L'attention s'est tournée récemment vers l'utilisation de bactéries à gram + commensales comme vecteurs d'antigènes. Leur totale innocuité, alliée aux capacités de certaines d'entre elles à coloniser les cavités corporelles externes, désigne les bactéries lactiques, en particulier les lactobacilles, comme candidats de choix pour délivrer des antigènes protecteurs au niveau des muqueuses.
Ces microorganismes présentent en outre l'avantage d'être aisément administrables par voie orale ou locale. De plus, l'industrie agroalimentaire a développé pour les levains laitiers un important savoir-faire technologique.

Un programme de recherche concertée soutenu par la communauté européenne a permis d'établir la faisabilité de l'approche proposée. Il a été suivi de dispositions qui visent essentiellement à une comparaison contrôlée de trois genres de bactéries lactiques : Lactococcus lactis, Streptococcus gordonii et Lactobacillus. Le laboratoire de Bactériologie du Département de Microbiologie de Ecosystèmes est coordonnateur du réseau et s'intéresse en particulier à développer les lactobacilles comme auxiliaires vivants de vaccination. Ceci nécessite de traiter trois domaines en parallèle :

• microbiologie : études de persistance chez la souris,
• biologie moléculaire : production d'antigènes modèles dans différentes localisations cellulaires (cytoplasmique, ancrage à la paroi et, éventuellement, sécrétion),
• immunologie : analyse de la réponse immune induite, chez la souris, après administrations locales de lactobacilles recombinants.

La sous-unité C de la toxine tétanique (TTFC) et la protéine gp50 du virus porcin d'Aujeszky (gp50 de l'ADV) sont actuellement utilisées comme antigènes modèles. Les progrès réalisés peuvent être résumés comme suit :

• construction de souches recombinantes de L. plantarum NCIMB8826 (souche d'origine humaine) produisant la TTFC (expression cytoplasmique ou en surface), le gène correspondant étant porté par des plasmides réplicatifs ou stabilisé par intégration chromosomique,
• mise en oeuvre d'un système d'expression inductible (système nisine) chez L. plantarum, permettant notamment d'établir des courbes dose-réponse pour l'effet biologique étudié,
• développement du marqueur GFP (Green Fluorescent Protein) pour faciliter le suivi des souches in vivo,
• démonstration de l'immunogénicité (induction de réponses anticorps systémiques et locales) des souches L. plantarum produisant la TTFC, par voies nasale et intragastrique et induction d'une protection contre un test d'épreuve létale.

Au cours du projet "vaccin", plusieurs questions ayant trait au caractère probiotique des bactéries lactiques ont été soulevées. C'est ainsi que le pouvoir immunomodulateur et l'adjuvanticité de différentes souches ont été comparées, illustrant une importante variabilité en fonction des souches.
La finalité de cette étude est de clarifier l'impact de la microflore du tube digestif sur le système immunitaire de l'hôte, en particulier dans le cadre de maladies intestinales chroniques et inflammatoires telles que la maladie de Crohn.
L'étude d'agents bactériens associés au déclenchement de cette pathologie est également intéressante il s'agit du projet probiotique.

II - Ecologie du parasitisme

II.1. Biodiversité de Pneumocystis et ses conséquences épidémiologiques

Nous avons mis en évidence chez Pneumocystis carinii un polymorphisme génétique qui est fonction de l'espèce du mammifère hôte. Ce phénomène traduit l'existence de lignées de Pneumocystis génétiquement stables, inféodées à chaque espèce hôte. Il s'exprime sur le plan phénotypique aux niveaux ultrastructural, isoenzymatique, antigénique et de l'infectivité.
Des infections croisées expérimentales ont confirmé qu'il existe une forte spécificité parasitaire chez Pneumocystis. Cette situation nous a conduit d'une part à nous intéresser en priorité aux organismes du genre Pneumocystis parasitant l'homme, et d'autre part à rechercher les sources et les mécanismes de l'infection humaine, véritables objectifs spécifiques de notre programme.
Une phase critique du projet est le développement d'un système de culture permettant d'isoler Pneumocystis des patients et de perpétuer ces isolats in vitro, afin d'ajouter à leur caractérisation génomique, l'étude de leurs propriétés biologiques (capacité proliférative et d'attachement, susceptibilité à des molécules antiparasitaires ou antifongiques).

Des travaux ont fourni des résultats marquants dans les domaines de la culture de P. carinii et de sa transmission. Ces recherches se développent dans le cadre d'un projet-réseau (9 groupes français et un anglais), intitulé : "Présence et circulation de micro-organismes du genre Pneumocystis dans les écosystèmes".

Pour juger du développement de Pneumocystis in vitro il fallait d'abord établir son temps de doublement in vivo. Des études approfondies de la cinétique des Pneumocystis dans trois modèles animaux ont révélé des différences importantes dans le temps de doublement : 1.5 jours chez le lapin (pneumocystose spontanée), 4.5 jours chez le rat sous corticostéroïdes et 10.3 jours chez la souris SCID. Ensuite, il fallait déterminer in vitro l'évolution des stades parasitaires.
Cette étude a été effectuée sur des parasites de rat, soit en culture axénique, soit en co-culture sur cellules épithéliales alvéolaires. Les temps de doublement (environ 90 heures) ont été proches de ceux enregistrés in vivo. Pour la première fois il a été établi que des nouvelles formes kystiques sont générées in vitro et qu'elles évoluent à maturité en produisant effectivement des formes végétatives capables de se diviser à leur tour (au moins dans des cultures axéniques). Un modèle heuristique du développement de Pneumocystis a été conçu sur ces bases.

II.1.2. Transmission de Pneumocystis : rôle des porteurs

Pneumocystis peut persister de plusieurs semaines à environ 1 an dans le poumon de rats "convalescents", guéris de leur pneumocystose. Durant cette période, des hôtes immunocompétents peuvent contracter une infection transitoire par contact étroit avec des hôtes infectés. La question cruciale était de pouvoir établir si des hôtes immunocompétents parasités transitoirement par Pneumocystis peuvent transmettre l'infection à des hôtes immunodéprimés. La réponse est oui : des souris immunocompétentes en contact étroit avec des souris avec pneumocystose contractent une infection transitoire détectée par PCR.
Ces souris porteuses immunocompétentes mises à leur tour en contact étroit avec des souris SCID, transmettent l'infection à ces dernières qui développent une pneumocystose. Ce travail renforce l'hypothèse du rôle des porteurs dans la transmission et la circulation de Pneumocystis dans les populations humaines, notamment dans les hôpitaux.
En effet, la PCR a montré que des patients immunodéprimés sans pneumocystose peuvent héberger Pneumocystis. On considère ces porteurs comme des individus "colonisés" par le parasite. En collaboration avec un groupe du CHU d'Amiens, nous avons montré que le risque de colonisation pulmonaire par Pneumocystis chez les patients VIH-négatifs augmente avec la baisse des lymphocytes CD4+ sanguins, et qu'un même génotype de P. carinii hominis peut être responsable de colonisation pulmonaire ou de pneumocystose.

II.2. Nouvelles stratégies pour le contrôle de pathogènes émergents fondées sur le phénomène "killer"

Le phénomène "killer" désigne la propriété de nombreuses levures à sécréter des toxines ayant une activité létale ou inhibitrice vis-à-vis de micro-organismes cibles. Une toxine "killer" (PKT), produite par des levures du genre Pichia, nous intéresse particulièrement en raison de son activité létale contre des pathogènes procaryotes ou eucaryotes aussi divers que Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans et Pneumocystis carinii.
Comme PKT n'agit pas à des températures et pH physiologiques, des anticorps antiidiotypiques polyclonaux, monoclonaux et recombinants ont été générés à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-PKT (MabKT4) inhibant l'activité toxique. Ces anticorps ont montré in vitro un effet létal similaire à celui de PKT ainsi que des propriétés thérapeutiques in vivo dans des modèles expérimentaux de pneumocystose et de candidose. Comme ils ne sont pas utilisables en thérapeutique humaine, notre objectif est de caractériser le mécanisme d'action de PKT et de produire une molécule antimicrobienne recombinante, à spectre transphylétique, stable et active en conditions physiologiques.

Les principaux résultats concernent :
1. la purification de PKT,
2. la caractérisation moléculaire de son site de fixation sur les micro-organismes cibles.

Nous avons pu établir que PKT est une protéine de nature glycosylée d'environ 85 kDa. L'alignement de séquences internes et de la partie N-terminale de PKT native avec des séquences connues, révèle des similarités importantes avec la famille des protéines "SUN", récemment décrite, dont aucune fonction commune n'a pu être démontrée. Pour connaître le mode d'action de PKT, nous avons donc entrepris d'en isoler son gène et d'obtenir son expression dans un contexte hétérologue.

II.2.2. Caractérisation moléculaire du site de fixation de PKT sur les micro-organismes cibles.

Notre stratégie a été d'évaluer l'effet de PKT sur des mutants de Saccharomyces cerevisiae. PKT s'est avérée inactive contre des souches exprimant des mutations affectant la biosynthèse des béta-glucanes, sucres de parois fongiques (1-6 béta glucanes et 1-3 béta glucanes) qui pourraient interagir avec PKT, comme il a été montré pour d'autres toxines de levure.

II.3. Formes infectantes de protistes et micro-champignons opportunistes dans l'environnement : détection et identification moléculaire de Cryptosporidium

Cette thématique, axée au départ sur le développement de méthodes de détection et typage moléculaire de Cryptosporidium, a engendré un projet d'épidémiologie et taxonomie moléculaires dont les faits marquants sont les suivants :

II.3.1. Impact de la méthode US EPA-1622 sur Cryptosporidium

La méthode 1622 pour détecter Cryptosporidium dans les eaux (Agence de Protection de l'Environnement, USA), consiste à filtrer l'eau, à éluer les particules retenues sur le filtre et à les concentrer par centrifugation. Les oocystes sont ensuite purifiés par séparation immunomagnétique, identifiés et quantifiés par immunofluorescence. En collaboration avec le Service des Eaux et Environnement de l'Institut Pasteur de Lille (J.-M. DELATTRE), nous avons évalué l'impact de cette méthode sur les oocystes de C. parvum. Les étapes de filtration et de centrifugation (<5000 g) n'ont pas eu d'effets décelables, mais la phase d'élution peut induire un désenkystement prématuré, lié au tampon d'élution.

II.3.2. Identification moléculaire de Cryptosporidium

L'immunofluorescence ne permet pas la détermination de l'espèce de Cryptosporidium ni celle de l'espèce hôte d'origine, deux informations aujourd'hui capitales car deux génotypes principaux sont retrouvés chez C. parvum, l'un inféodé à l'espèce humaine et apparemment non infectant pour l'animal, l'autre propre au bétail, pouvant occasionnellement infecter l'homme. Pour cette raison nous avons développé, et validé sur des prélèvements cliniques, des techniques basées sur la PCR. La plupart des isolats humains se sont révélés être d'origine anthropophile, ce qui montre bien que la cryptosporidiose n'est pas nécessairement une zoonose, contrairement à ce qui est encore fréquemment affirmé. L'amplification suivie du séquençage d'un fragment du gène de l'ARNr 18S est pour le moment la technique la plus informative. Ce gène fournit le seul marqueur dont la séquence est connue chez toutes les espèces de Cryptosporidium (sauf chez C. nasorum). L'alignement de ces séquences permet ainsi de déterminer l'espèce, mais les zones hypervariables autorisent, en plus, un typage infraspécifique qui identifie des génotypes en fonction de l'espèce hôte (humain, bovin, canin, félin, etc.). Ce travail sera poursuivi par l'analyse d'isolats provenant d'animaux et de l'environnement.

II.3.3. Epidémiologie moléculaire de la cryptosporidiose

Des données récentes suggèrent que les patients VIH+ sont susceptibles à des nouveaux génotypes de Cryptosporidium. Cet aspect, de grande importance en santé publique, notamment dans le Tiers Monde, sera abordé dans le cadre de notre participation, avec un groupe haïtien et deux groupes français (CHU d'Amiens et de Rouen), au projet réseau : "Circulation de Cryptosporidium spp dans les écosystèmes en Haïti, conséquences pour les populations infectées par le VIH" soutenu par l'ANRS (VIH/PAL). L'objectif est de caractériser le réservoir et les sources d'infection par Cryptosporidium spp en Haïti, pays en voie de développement fortement touché par la pandémie de SIDA.

III - Virologie
III.1. Evaluation de la quantification moléculaire des Entérovirus infectieux comme marqueur de pollution virale des eaux de surface

L'eau est un vecteur important dans la transmission des maladies infectieuses virales. Bien qu'actuellement les virus véhiculés par l'eau, responsables de gastro-entérites ou de pathologies humaines diverses, ne soient pas toujours identifiés, le contrôle virologique des eaux de surface utilisées pour la baignade, l'irrigation ou la conchyliculture reste primordial pour la prévention des épidémies virales. Les études portant sur la propreté de l'eau ont tenté d'établir une corrélation entre la présence des marqueurs habituellement utilisés (bactéries, bactériophages) et la présence de virus. Plusieurs marqueurs ont été proposés mais aucun ne semble aujourd'hui faire référence dans le contrôle de la pollution virale des eaux. Les Entérovirus (famille des picornaviridae), de par leur résistance dans le milieu extérieur (restent infectieux pendant plusieurs mois), leur voie de transmission (fécal-oral) et leur présence en quantité importante dans les eaux usées pourraient représenter un marqueur intéressant de contamination virale des eaux de surface.
Un plan d'échantillonnage sur quatre sites de prélèvement, localisés sur la côte d'Opale (4 estuaires), et couvrant une année entière, à raison de 1 ou 2 prélèvements par mois, a été réalisé. Les analyses bactériologiques (détection des E . coli et entérocoques) et bactériophagiques (bactériophages somatiques et à ARN F-spécifiques), qui ont été effectuées au fur et à mesure des prélèvements, seront comparées à l'analyse virologique de l'eau. Cette dernière est en cours de réalisation et comporte la détection de plusieurs virus entériques véhiculés par les eaux usées (HAV, Norwalk I and II, Astrovirus, Rotavirus) et la mise en évidence d'éventuels entérovirus infectieux. Pour la détection des entérovirus infectieux, une nouvelle méthode, utilisant des techniques moléculaires rapides et permettant la quantification de la dose virale, est en cours de développement. A terme, l'étude nous permettra d'évaluer si la présence d'entérovirus infectieux est corrélée à celle d'autres virus et de comparer cette corrélation avec celle qui existe pour les autres marqueurs (bactéries, bactériophages).

III.2. Etude du rôle des Coxasackievirus B dans la physiopathologie des cardiomyopathies dilatées : détection et analyse des déterminants génétiques viraux associés à la persistance et à la cardiovirulence

Les Coxsackievirus B (sérotypes B1 à B6) sont des virus à ARN positif simple brin appartenant au genre entérovirus. Ils sont considérés comme des agents infectieux communs impliqués dans la physiopathologie des cardiomyopathies dilatées (CMD). Les résultats obtenus au laboratoire à l'aide de deux modèles expérimentaux d'infection cardiaque chronique (Souris DBA/2 et NMRI nu/nu), suggèrent que les gènes du coxsackievirus B3 codant pour les protéines de capside (VP1-VP4 ; 3 Kb) et pour les protéines non structurales (2A-3D; 3Kb) peuvent être impliqués dans les mécanismes de persistance et de cardiovirulence. Afin de vérifier cette hypothèse, des comparaisons de séquences ont été effectuées entre les ARN viraux extraits des myocardes de souris (DBA/2 et NMRI nu/nu) présentant une persistance du CVB3 associée à une CMD, les ARN viraux extraits du tissu cardiaque des souris avec une infection virale sans CMD, et l'ARN génomique du variant myocarditique CVB3-M1 inoculé à JO Les variations nucléotidiques rencontrées de façon systématique pour chaque mutant ont été identifiées. Des génomes viraux hybrides, obtenus par clonage et par mutagenèse dirigée (à partir du cDNA du variant CVB3-M1), sont en cours de construction et seront ensuite inoculés aux lignées murines DBA/2 et NMRI nu/nu afin d'identifier les mutations associées à la persistance virale et la cardiovirulence. Les résultats de ce travail permettront une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires des infections cardiaques persistantes à Coxsackievirus B3, et rendront possibles des études cliniques pour identifier le génotype de souches potentiellement cardiovirulentes.